骨再生和重塑過程中，神經再支配至關重要，但骨組織工程中神經網絡重建仍是挑戰，導致成骨受限。神經生長因子（NGF）在骨愈合早期引導神經支配，骨形態發生蛋白（BMPs）在骨愈合過程中持續表達并誘導成骨分化，但天然生長因子存在穩定性差、劑量高、成本高等問題，且神經營養因子與成骨相關生長因子的持續共遞送及神經調控骨再生的機制研究較少。   
     來自中山大學深圳校區生物醫學工程學院的張超教授團隊與南方醫科大學材料研究中心的廖立瓊教授團隊合作，設計并構建了一種3D打印微球-水凝膠支架，通過聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球包封BMP-2模擬肽、水凝膠基質負載NGF模擬肽，實現了NGF模擬肽的快速釋放和BMP-2模擬肽的長期緩釋。該支架通過可編程釋放生長因子模擬肽，促進神經網絡重建和骨再生，并深入探究了神經-骨串擾的分子機制。相關工作以“3D Printed Microsphere〩ydrogel Scaffold Facilitates Restoration of Reinnervation in Bone Regeneration through Programmable Release of NGF/BMP-2 Mimetic Peptides”為題發表在《Advanced Healthcare Materials》上。

研究內容
1. 墨水流變性能與支架表征，通過流變測試（剪切速率、溫度、頻率對粘度及模量的影響）、掃描電子顯微鏡（SEM）觀察、釋放曲線測定及力學性能測試等方法，研究了含GelMA、mPGA及PLGA微球的打印墨水特性及3D打印支架性能。結果表明，墨水呈非牛頓流體剪切變稀特性，20°C時粘度適宜打印，支架結構完整、孔隙清晰，PLGA微球均勻分散于絲材中；NGF模擬肽3天累計釋放82.94±6.75%，BMP-2模擬肽通過微球-水凝膠靜電作用實現8周74.31±3.86%持續釋放，壓縮強度和腫脹率分別達優化水平，4周水解失重約11.51±2.58%。   
 

2. 體外神經分化能力   通過PC12細胞（腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）神經突分化染色、RSC96細胞（施萬細胞）Transwell遷移實驗及免疫熒光定量分析，研究了支架提取物對神經細胞的作用。結果顯示，含NGF模擬肽的B-N+和B+N+組誘導PC12細胞形成長軸突（神經突長度顯著增加），神經突陽性細胞比例提升；B+N+組RSC96細胞遷移數量最多，證實NGF模擬肽快速釋放可加速神經網絡形成，BMP-2模擬肽亦有協同促進作用。   
 

3. 體外成骨分化能力   通過BMSCs與DRGs（背根神經節）共培養體系，結合ALP染色、茜素紅礦化結節染色及RT-qPCR檢測，研究了支架對成骨分化的影響。結果表明，B+N+組ALP活性最高，鈣結節沉積量顯著多于其他組，成骨基因ALP、OCN、Col I表達水平上調，且依賴CGRP（降鈣素基因相關肽）介導的AMPK-CREB1信號通路，而RUNX2表達主要受BMP-2模擬肽調控。   
 

4. 突觸囊泡胞吐效應分析   通過FM1-43熒光標記DRGs（背根神經節）內感覺神經元的突觸囊泡，實時觀察NGF模擬肽對囊泡胞吐的影響。結果顯示，加入NGF模擬肽后，DRGs熒光強度在3分鐘內顯著下降，表明突觸囊泡釋放速率加快，而BMP-2模擬肽對囊泡活性無明顯影響。該實驗證實NGF模擬肽通過促進神經遞質快速分泌，啟動神經-骨串擾的早期信號傳導。   
 

5. 神經-骨串擾分子機制   通過ELISA檢測CGRP濃度、Western blotting分析信號蛋白，研究了NGF模擬肽調控成骨的機制。結果顯示，NGF模擬肽顯著提升DRGs培養上清中CGRP濃度，激活AMPK和CREB1磷酸化，進而上調成骨轉錄因子SP7；抑制AMPK（Compound C處理）可阻斷該通路，證實其通過CGRP-AMPK-CREB1-SP7軸促進成骨，與BMP-2模擬肽的Smad通路形成協同。   
 

6. 體內骨再生與神經再支配評估   通過大鼠顱骨5mm臨界缺損模型，結合Micro-CT三維重建、H&E染色、Masson三色染色及β-tubulin/OCN免疫熒光，研究了支架的體內療效。結果顯示，8周時B+N+組BV/TV（骨體積/總體積）和Tb.Th（骨小梁厚度）最高，Tb.Sp（骨小梁間距）最小，新生骨與宿主骨整合緊密，β-tubulin陽性神經纖維侵入缺損中心，OCN陽性成骨區域顯著擴大，表明雙因子協同促進神經-骨再生耦合。   
 

7. 組織學與免疫熒光分析  通過H&E染色觀察炎癥反應、Masson染色評估膠原纖維生成及β-tubulin/OCN雙標染色定位神經-骨界面，研究了支架的生物相容性和再生微環境。結果顯示，各組均無明顯炎癥，B+N+組8周時可見大量成熟膠原纖維沿支架孔隙排列，β-tubulin陽性神經纖維密度最高，OCN陽性礦化區域覆蓋缺損中心，驗證了神經再支配對骨再生的引導作用。   
 

8. 神經與骨相關蛋白定量分析   通過免疫熒光染色定量β-tubulin陽性神經區域和OCN陽性骨組織面積，研究了支架對神經-骨耦合的調控效果。結果表明，B+N+組β-tubulin陽性面積較對照組增加約2倍，OCN陽性面積提升3倍以上，證實NGF/BMP-2模擬肽共遞送可同步增強神經纖維侵入和成骨活性，實現類生理條件下的骨愈合微環境重建。   
 

研究結論
本研究成功設計并構建了一種負載雙NGF/BMP-2模擬肽的3D打印支架。體外實驗表明，該支架快速釋放的NGF模擬肽可促進PC12細胞神經分化及RSC96細胞遷移，模擬了骨痂形成過程中NGF的時序釋放特征；而持續釋放的BMP-2模擬肽可有效促進骨髓間充質干細胞成骨分化。機制研究發現，NGF模擬肽通過加速突觸囊泡釋放CGRP，激活AMPK-CREB1信號通路，與BMP-2模擬肽的Smad通路協同增強成骨分化。體內實驗證實，該支架可促進宿主神經纖維侵入缺損部位，重建神經網絡，進而顯著提升新骨再生效率。綜上，本研究開發的3D打印微球-水凝膠支架通過模擬天然生長因子的時序釋放模式，為骨組織工程中神經化骨再生提供了一種有前景的策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202501594

(責任編輯：admin)

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