重組蜘蛛蛋白為創造新的生物材料提供了許多可能性。然而，它們的多態性和易于聚集的特性在其生產和實際應用中都提出了挑戰。香港城市大學胡金蓮院士及其團隊報道，突變重組蜘蛛蛋白在37°C和可見光照射下可快速、可控地形成水凝膠。在突變蜘蛛蛋白中，苯丙氨酸殘基（F）被（GGX）重復序列中的酪氨酸殘基（Y）取代，這有助于β-sheet的自組裝和進一步形成淀粉樣納米原纖維。膠束/球狀蜘蛛蛋白溶液轉化為由納米原纖維網絡組成的蜘蛛蛋白水凝膠，隨后通過雙酪氨酸進一步交聯。通過光譜學、透射電子顯微鏡（TEM）和分子動力學模擬驗證其構象轉變過程。此外，蜘蛛蛋白水凝膠根據其良好的生物相容性、剪切減薄性能和納米原纖維網絡結構，被用作生物墨水和仿生細胞支架。本研究結果揭示了蜘蛛蛋白的結構轉化機制，并擴展其在生物醫學工程中的應用。

    相關研究內容以“Rapidly Forming Recombinant Miniature Spidroins Hydrogels Composed of Nanofibrils with Tunable Mechanical Properties for Bio 3D Printing and Biomimetic Cellular Scaffolds”為題于2024年12月26日發表在《Advanced Functional Materials》上。  

與蜘蛛蛋白相比，M-蜘蛛蛋白在凝膠形成過程中更容易從膠束/球中轉化為β-sheet和淀粉樣納米原纖維，并可以通過雙酪氨酸進一步交聯（圖1c-e）。為了保持蛋白質結構的完整性，本研究進行了一個保守突變，用酪氨酸（Y）取代MaSp2中的苯丙氨酸（F），設計的蜘蛛蛋白和突變蜘蛛蛋白的核心結構域序列如圖1a所示。微型MaSp2由329個氨基酸組成，其中MaSp2結構域的一個重復區域位于NT和CT的兩側（圖1b）。

設計的蛋白質由大腸桿菌（E. coli）生產，通過固定化金屬親和層析（IMAC）和尺寸排斥色譜柱進一步純化，并通過SDS-PAGE進行表征（圖2a）。蜘蛛蛋白和突變蜘蛛蛋白制劑的蛋白產率分別為116 ± 14和121±24mg L−1。由于突變，范德華力和靜電相互作用更強，蛋白質傾向于自組裝（圖2e）。蜘蛛蛋白/M-蜘蛛蛋白水溶液可以在37℃下快速形成水凝膠，并通過藍光進一步交聯（圖3a、b）。為研究蜘蛛蛋白在凝膠化過程中的結構轉化，首先采用圓二色性（CD）。如圖2b所示，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的CD光譜顯示，在208和223 nm處出現強峰，表明蛋白質在所有溫度下的構象主要是α-螺旋和隨機螺旋結構。隨著溫度從10°C增加到70°C，兩種蛋白開始展開螺旋，β-sheet的含量從4.15增加到17.61%（圖2c）。蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白在4°C和37 °C水溶液中的快照如圖2d、e所示。此外，還計算了不同溫度下蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白中2個REP區域之間的定向平均相互作用自由能（圖2f、g）。為深入了解M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的結構轉換過程，應用FTIR和XRD光譜對二級結構進行定量訪問（圖3c-j）。M-蜘蛛蛋白和蜘蛛蛋白在水溶液中都以直徑為25 nm的球狀或膠束的形式存在（圖3k）。在37°C孵育1小時后，蜘蛛蛋白轉化為淀粉樣納米原纖維并形成水凝膠（圖3l、m）。交聯的M-蜘蛛蛋白水凝膠表現為更長、更薄的納米原纖維的聚集物（圖3n）。   
 

滲透斜坡實驗表明，蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白溶液的存儲模量均隨溫度的升高而增加，而隨著溫度降低，存儲模量沒有下降到之前的值，但仍高于損失模量（圖4a），表明形成一種熱不可逆、穩定的水凝膠。此外，M-蜘蛛蛋白溶液可以在可見光控制下的2 min內形成水凝膠（圖4b）。從SEM圖像中觀察到水凝膠的孔隙大小約為10μm（圖4c、d）。在恒定頻率為1rad s−1下進行的振蕩振幅掃描顯示，這些水凝膠樣品在0.1-5%的應變范圍內具有彈性。然而，當蛋白質濃度從150mg下降到50 mg mL−1時，線性粘彈性區域從9%轉移到3%（圖4e）。通過控制蛋白質的濃度，可以很容易調整水凝膠的機械強度（圖4f）。與本研究結果相比，之前報道的凝膠化時間更長，凝膠化溫度明顯更高，并且所得到的水凝膠通常不透明（圖4g）。
 

      本研究進一步證明了M-蜘蛛蛋白適用于生物技術應用（圖5）。采用振蕩剪切流變學分析方法，對M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝膠在交聯前的可打印性進行評價。所有濃度的水凝膠都表現出剪切變薄行為（圖5a）。高應變振蕩（200%）使水凝膠轉變為更具粘性的狀態（圖5b）。基于剪切稀釋和恢復性能，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝膠適用于3D打印，因此打印了支架，并根據針的尺寸、打印速度和壓力等優化打印條件（圖5c、d）。用小鼠胚胎纖維母細胞評價M-蜘蛛蛋白生物墨水的細胞活力和增殖能力。與商用的絲素纖維蛋白生物墨水相比（圖5e-g），M-蜘蛛蛋白生物墨水具有更高的活力（>95%），并與絲素生物墨水一樣增殖。然后將M-蜘蛛蛋白與人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）混合，采用不同的處理方法制備生物墨水。四個小塊和一個水凝膠的“CITYU”圖案通過可見光固化（圖5h）。“CITYU”水凝膠用CD31和Hoechst染色（圖5i）。用Calcein/PI染色，共聚焦顯微鏡觀察兩種圖案水凝膠。由于納米纖維網絡結構，培養5天后觀察到90%以上的細胞活力（圖5j）。對于生物3D生物打印，將細胞裝入M-蜘蛛蛋白溶液中，在擠壓前以37°C孵育60分鐘，該支架由機械臂打印，并通過藍光進一步固化（圖5k）。免疫染色分析的結果證實HUVECs在第7天表達CD31（圖5i-m）。以上結果表明，M-蜘蛛蛋白兼容不同的模式方法，并支持細胞的生長和增殖。   

全文小結
     綜上所述，本研究制備了一種基于結構轉化的微型重組蜘蛛蛋白水凝膠，可應用于生物3D打印和細胞支架。揭示了凝膠化過程中蜘蛛蛋白構象轉變的機理，并通過CD、FTIR、XRD譜、TEM和理論計算進行驗證。高濃度的M-蜘蛛蛋白（膠束結構）可轉化為淀粉樣納米原纖維，誘導水凝膠形成，并可通過雙酪氨酸進一步交聯。因此，M-蜘蛛蛋白可以非常迅速地形成水凝膠，交聯水凝膠表現出可調的力學性能。此外，本研究還展示了M-蜘蛛蛋白作為生物墨水進行3D打印的應用，以及與ECM相似的納米纖絲網絡結構，可以促進細胞增殖。由結構轉化衍生而來的M-蜘蛛蛋白水凝膠的概念為創建具有先進特性的功能化水凝膠提供可能性，可用于廣泛的應用，如酶的錨定、可控藥物釋放和組織工程。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202420059 

(責任編輯：admin)

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