清華大學熊卓和張婷教授課題組: 功能性心肌腔室的工程化構建最新進展
時間：2022-01-18 14:41 來源：生物打印再生工程 作者：admin 閱讀：次
在過去的幾十年里，心臟組織工程領域取得了進步。然而，大多數研究進展僅限于具有簡單拓撲結構的微尺度工程化心肌組織
(ECT)，如3D條帶和心肌補片。盡管微尺度ECT有利于藥物篩選應用，但它們在心臟修復和心臟疾病體外建模方面的應用十分有限。最近，研究人員進行了各種嘗試來構建工程化心肌腔室
(ECP)，例如腔室，以重現天然心臟的結構復雜性。從微尺度ECT到宏觀ECP的轉變將大大加速其應用；然而，研究人員面臨著拓撲結構重建、血管化和功能成熟等障礙。
近日，清華大學機械工程系的熊卓和張婷教授課題組（BRE團隊）在Biomaterials發表了一篇名為“Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: a review”的綜述文章，總結了生物工程方法制造功能性工程化心肌腔室的最新進展。文章回顧了制造ECP的生物工程方法，總結了目前在微尺度和中觀尺度上設計血管系統的方法，介紹了使心臟組織功能成熟的各種策略，并對未來提出了展望。
背景介紹
在全球范圍內，心血管疾病是人類死亡的主要原因，其患病率也在隨著人口老齡化而增加。當向心臟供血的動脈被阻塞時，心肌梗死與缺血性損傷有關，瘢痕組織中的纖維狀膠原蛋白和成纖維細胞取代死亡的心肌細胞(CM)，永久性降低泵血能力，最終導致心力衰竭。成人心臟是人體再生率最少的器官之一，心肌細胞每年的周轉率約為0.3-1%。迄今為止，心臟移植仍然是治療晚期心力衰竭的金標準，而供體器官長期短缺和免疫排斥一直是巨大的挑戰。因此，需要尋找治療缺血性心臟病的替代策略。
干細胞療法是一種很有前景的治療方法。在過去15年中，許多臨床實踐取得了進展，但仍有一些問題需要解決，包括腫瘤發生風險、移植物免疫排斥和移植物細胞死亡等。此外，這種方法的長期治療效果存在爭議，因為目前的分娩途徑，包括冠狀動脈注射、靜脈注射和心肌注射，導致細胞保留率/移植率低(<1%)和存活率低。在過去十年中，研究人員開始認識到干細胞療法主要通過旁分泌機制來發揮作用。因此，使用非編碼RNA包括微RNA(miRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)和外泌體等方法吸引了越來越多的興趣。此外，研究人員最近報道，使用特定的轉錄因子組合，能夠將心肌梗死后的瘢傷組織直接重編程到心肌細胞中，并在體內和體外都得到了驗證。然而，盡管存在可行性且前景誘人，但應該指出，這些概念仍處于起步階段，需要在臨床應用前對安全性和有效性進行系統驗證。
此外，心臟組織工程也是一種治療方法。心臟組織工程的重點是在體外創造有功能的心臟組織替代物來替代或恢復受損的心肌。除心臟修復外，工程化心肌組織還可用于藥物篩選和體外心臟功能和疾病建模。在過去的幾十年里，心臟組織工程領域有兩個截然不同的方向。一個方向是在微尺度上發展具有最小結構復雜性的功能性工程心肌組織(ECT)，如3D條帶和心肌補片。微尺度ECT的厚度通常小于500 μm，不需要引入血管系統來滿足其代謝需求。相對較小的體積有利于其存活和體外成熟，此外，微尺度ECT能夠產生力并對藥物做出可預測反應。由于ECT拓撲結構重建簡單，且具有高通量和標準化的特點，其可應用于藥物篩選。
另一個方向是在宏觀尺度上開發工程化心肌腔室(ECP)，包括工程人類心室和完整的心臟模型。目前，在嚙齒類動物實驗中有治療效果的心臟心肌補片需要擴大，以滿足人類移植物的要求。更重要的是，單純擴大心臟心肌補片可能不足以完全恢復受損心臟的功能。對于先天性心臟病，如左心室發育不良綜合征，工程心室可能是一個更好的移植選擇。而對于終末期心力衰竭，在未來可能需要一個工程全心來代替捐贈的心臟。與微尺度ECT相比，宏觀ECP可作為研究心功能和疾病的更理想模型。ECP可以評估壓力-容積指標，并具有人類心臟的功能，因此有望最終取代動物模型。
在過去的幾年里，許多研究人員對制造ECP進行了各種嘗試。2018年，Parker的團隊通過在橢圓形電紡絲支架上播種細胞，開發了一個類似心室的腔室。然而，由于固有的低細胞播種效率(通常小于107個細胞/cm3)，工程心室的壁厚被限制在100 μm左右，導致收縮強度小得多，僅相當于其原生心室的2%左右。3D生物打印技術，特別是新型的嵌入式擠出生物打印技術，已成為制造工程化心肌腔室更理想的方法。2019年，Dvir的團隊通過在懸浮介質中打印載有細胞的脫細胞胞外基質生物墨水，生成了一個全尺寸的心臟模型。但由于體外培養時間不夠長，該模型未能實現大尺度收縮功能。最近，基于懸浮水凝膠的自由形式可逆嵌入 (FRESH) 技術，Feinberg團隊產生了接近生理細胞密度(約3×108個細胞/cm3)和同步搏動能力的開放心室，以及一個無細胞全尺寸人類心臟模型。同樣，Ogle的團隊在懸浮介質中通過3D打印產生封閉的心室，其細胞密度接近于人誘導多能干細胞的原位增殖和分化所獲得的生理細胞密度(約3×108個細胞/cm3)。然而，由于缺乏血管，這些研究中工程腦室的壁厚限制在200μm左右。到目前為止，大尺度ECP的發展仍處于起步階段，ECP內單個心肌細胞的成熟度仍然不足。
從微尺度ECT到宏觀ECP，以及最終完整的心臟移植物的實現與幾個關鍵挑戰有關，包括拓撲結構重建、血管化和功能成熟(圖1)。本文的目的是回顧這些領域的最新技術進展，并為功能性ECP的進一步實現提供思路。在文章中，首先介紹了重構天然心臟的復雜拓撲結構重建特征的生物工程方法，并強調接近生理的細胞密度的作用，這對其生理功能至關重要。對于厚心臟組織和ECP來說，多尺度血管的整合是維持細胞活力所必需的。因此，本文也討論了心臟組織的血管化策略及其在宏觀ECP中的潛在適用性。此外，本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟機制，強調了它們促進單個心肌細胞成熟的能力以及它們在宏觀ECP中的適用性。最后，本文針對相關挑戰、趨勢機遇，提出了一系列重要觀點。
工程化心肌腔室(ECP)的制造
在過去的幾十年里，出現了多種制造技術來設計制造工程化心肌組織和工程化心肌腔室。這些技術通常分為兩類，即自上而下的策略和自下而上的策略。不同的制造技術重現天然心臟的結構復雜性和細胞密度的能力存在差異(圖2)。自上而下的策略包括支架接種和水凝膠澆鑄的方法。盡管支架接種方法具有構建復雜結構的能力，但細胞接種密度較低(通常小于107/cm3)。水凝膠注模策略能夠實現高細胞密度，但只能形成較為簡單的拓撲結構重建。基于載細胞微單元模塊化組裝的自下而上策略包括自組裝、遠程組裝和定向組裝方法。其中，3D生物打印通過逐層精確定位細胞和生物材料，已成為最有前景的工程化心肌腔室構建方法。展望未來，工程化全心臟的最終實現方案可能在于細胞自組裝和3D生物打印技術的融合。
工程化心肌腔室(ECP)的血管化
天然心臟是高度血管化的器官。分級血管系統向單個心肌細胞輸送必需的營養和氧氣，并通過旁分泌信號促進心肌成熟和整體收縮功能。對于厚心臟組織的再生，促進營養交換的體外動態培養只能在有限的擴散距離下維持細胞活力，而宿主血管系統生長進入工程組織的血管生成過程通常需要數天到數周時間，無法提供及時的營養供應。因此，在移植時加入血管網絡，并促進其與宿主血管系統的整合對于確保厚心臟組織的細胞活力和功能成熟至關重要，ECP也是如此。
近日，清華大學機械工程系的熊卓和張婷教授課題組（BRE團隊）在Biomaterials發表了一篇名為“Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: a review”的綜述文章，總結了生物工程方法制造功能性工程化心肌腔室的最新進展。文章回顧了制造ECP的生物工程方法，總結了目前在微尺度和中觀尺度上設計血管系統的方法，介紹了使心臟組織功能成熟的各種策略，并對未來提出了展望。
背景介紹
在全球范圍內，心血管疾病是人類死亡的主要原因，其患病率也在隨著人口老齡化而增加。當向心臟供血的動脈被阻塞時，心肌梗死與缺血性損傷有關，瘢痕組織中的纖維狀膠原蛋白和成纖維細胞取代死亡的心肌細胞(CM)，永久性降低泵血能力，最終導致心力衰竭。成人心臟是人體再生率最少的器官之一，心肌細胞每年的周轉率約為0.3-1%。迄今為止，心臟移植仍然是治療晚期心力衰竭的金標準，而供體器官長期短缺和免疫排斥一直是巨大的挑戰。因此，需要尋找治療缺血性心臟病的替代策略。
干細胞療法是一種很有前景的治療方法。在過去15年中，許多臨床實踐取得了進展，但仍有一些問題需要解決，包括腫瘤發生風險、移植物免疫排斥和移植物細胞死亡等。此外，這種方法的長期治療效果存在爭議，因為目前的分娩途徑，包括冠狀動脈注射、靜脈注射和心肌注射，導致細胞保留率/移植率低(<1%)和存活率低。在過去十年中，研究人員開始認識到干細胞療法主要通過旁分泌機制來發揮作用。因此，使用非編碼RNA包括微RNA(miRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)和外泌體等方法吸引了越來越多的興趣。此外，研究人員最近報道，使用特定的轉錄因子組合，能夠將心肌梗死后的瘢傷組織直接重編程到心肌細胞中，并在體內和體外都得到了驗證。然而，盡管存在可行性且前景誘人，但應該指出，這些概念仍處于起步階段，需要在臨床應用前對安全性和有效性進行系統驗證。
此外，心臟組織工程也是一種治療方法。心臟組織工程的重點是在體外創造有功能的心臟組織替代物來替代或恢復受損的心肌。除心臟修復外，工程化心肌組織還可用于藥物篩選和體外心臟功能和疾病建模。在過去的幾十年里，心臟組織工程領域有兩個截然不同的方向。一個方向是在微尺度上發展具有最小結構復雜性的功能性工程心肌組織(ECT)，如3D條帶和心肌補片。微尺度ECT的厚度通常小于500 μm，不需要引入血管系統來滿足其代謝需求。相對較小的體積有利于其存活和體外成熟，此外，微尺度ECT能夠產生力并對藥物做出可預測反應。由于ECT拓撲結構重建簡單，且具有高通量和標準化的特點，其可應用于藥物篩選。
另一個方向是在宏觀尺度上開發工程化心肌腔室(ECP)，包括工程人類心室和完整的心臟模型。目前，在嚙齒類動物實驗中有治療效果的心臟心肌補片需要擴大，以滿足人類移植物的要求。更重要的是，單純擴大心臟心肌補片可能不足以完全恢復受損心臟的功能。對于先天性心臟病，如左心室發育不良綜合征，工程心室可能是一個更好的移植選擇。而對于終末期心力衰竭，在未來可能需要一個工程全心來代替捐贈的心臟。與微尺度ECT相比，宏觀ECP可作為研究心功能和疾病的更理想模型。ECP可以評估壓力-容積指標，并具有人類心臟的功能，因此有望最終取代動物模型。
在過去的幾年里，許多研究人員對制造ECP進行了各種嘗試。2018年，Parker的團隊通過在橢圓形電紡絲支架上播種細胞，開發了一個類似心室的腔室。然而，由于固有的低細胞播種效率(通常小于107個細胞/cm3)，工程心室的壁厚被限制在100 μm左右，導致收縮強度小得多，僅相當于其原生心室的2%左右。3D生物打印技術，特別是新型的嵌入式擠出生物打印技術，已成為制造工程化心肌腔室更理想的方法。2019年，Dvir的團隊通過在懸浮介質中打印載有細胞的脫細胞胞外基質生物墨水，生成了一個全尺寸的心臟模型。但由于體外培養時間不夠長，該模型未能實現大尺度收縮功能。最近，基于懸浮水凝膠的自由形式可逆嵌入 (FRESH) 技術，Feinberg團隊產生了接近生理細胞密度(約3×108個細胞/cm3)和同步搏動能力的開放心室，以及一個無細胞全尺寸人類心臟模型。同樣，Ogle的團隊在懸浮介質中通過3D打印產生封閉的心室，其細胞密度接近于人誘導多能干細胞的原位增殖和分化所獲得的生理細胞密度(約3×108個細胞/cm3)。然而，由于缺乏血管，這些研究中工程腦室的壁厚限制在200μm左右。到目前為止，大尺度ECP的發展仍處于起步階段，ECP內單個心肌細胞的成熟度仍然不足。
從微尺度ECT到宏觀ECP，以及最終完整的心臟移植物的實現與幾個關鍵挑戰有關，包括拓撲結構重建、血管化和功能成熟(圖1)。本文的目的是回顧這些領域的最新技術進展，并為功能性ECP的進一步實現提供思路。在文章中，首先介紹了重構天然心臟的復雜拓撲結構重建特征的生物工程方法，并強調接近生理的細胞密度的作用，這對其生理功能至關重要。對于厚心臟組織和ECP來說，多尺度血管的整合是維持細胞活力所必需的。因此，本文也討論了心臟組織的血管化策略及其在宏觀ECP中的潛在適用性。此外，本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟機制，強調了它們促進單個心肌細胞成熟的能力以及它們在宏觀ECP中的適用性。最后，本文針對相關挑戰、趨勢機遇，提出了一系列重要觀點。
圖1 體外構建工程化心肌腔室(ECP)的主要挑戰
工程化心肌腔室(ECP)的制造
在過去的幾十年里，出現了多種制造技術來設計制造工程化心肌組織和工程化心肌腔室。這些技術通常分為兩類，即自上而下的策略和自下而上的策略。不同的制造技術重現天然心臟的結構復雜性和細胞密度的能力存在差異(圖2)。自上而下的策略包括支架接種和水凝膠澆鑄的方法。盡管支架接種方法具有構建復雜結構的能力，但細胞接種密度較低(通常小于107/cm3)。水凝膠注模策略能夠實現高細胞密度，但只能形成較為簡單的拓撲結構重建。基于載細胞微單元模塊化組裝的自下而上策略包括自組裝、遠程組裝和定向組裝方法。其中，3D生物打印通過逐層精確定位細胞和生物材料，已成為最有前景的工程化心肌腔室構建方法。展望未來，工程化全心臟的最終實現方案可能在于細胞自組裝和3D生物打印技術的融合。
圖2 體外構建心肌組織的生物工程策略。自上而下的策略包括支架接種(a)和水凝膠注模(c)；自下而上策略包括自組裝、遠程組裝和定向組裝(b)。
圖3 工程化心肌腔室(ECP)制造方法。通過在旋轉橢圓形收集器上拉紡纖維制成納米纖維心室形支架，接種多能干細胞分化的心肌細胞并用導管傳感器縫合在管道上，在施加外部壓力的生物反應器中培養(a)；在灌注生物反應器中將完整大鼠心臟再細胞化(b)；在定制的模具中鑄造類器官并依次從模具中取出，構建的人類心室樣心腔(c)；通過噴墨打印構建半心臟模型(d)；在支撐槽內打印帶有三腳架血管和分離的左右心室的心臟模型(e)；通過FRESH技術打印的接近生理細胞密度的開放心室(f)。
工程化心肌腔室(ECP)的血管化
天然心臟是高度血管化的器官。分級血管系統向單個心肌細胞輸送必需的營養和氧氣，并通過旁分泌信號促進心肌成熟和整體收縮功能。對于厚心臟組織的再生，促進營養交換的體外動態培養只能在有限的擴散距離下維持細胞活力，而宿主血管系統生長進入工程組織的血管生成過程通常需要數天到數周時間，無法提供及時的營養供應。因此，在移植時加入血管網絡，并促進其與宿主血管系統的整合對于確保厚心臟組織的細胞活力和功能成熟至關重要，ECP也是如此。
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