清華大學熊卓和張婷教授課題組: 功能性心肌腔室的工程化構建最新進展(2)
時間：2022-01-18 14:41 來源：生物打印再生工程 作者：admin 閱讀：次
人類心臟中的分層血管系統包括動脈、小動脈、靜脈、小靜脈和毛細血管，直徑跨越幾個數量級。除內皮內層和基底膜外層外，微尺度毛細血管還稀疏地被周皮細胞覆蓋，而中尺度小動脈和大尺度動脈則被平滑肌細胞以及彈性蛋白和膠原纖維結合。毛細血管在大約200 μm的距離內為實質細胞提供有效的營養和氧氣交換，而肌肉動脈和小動脈控制著血液的搏動流動(圖4a)。到目前為止，研究人員在工程組織中微血管和中尺度血管的形成方面分別取得了很大進展(圖4b-f)。內皮細胞可在載細胞基質中自組裝形成微尺度毛細血管，然而它們往往難以在體外灌注并在體內與宿主血管相吻合。生物工程方法可生成數百微米至數毫米的中尺度血管，并與宿主血管結合，然而它們不能有效地將營養物質輸送到周圍組織。因此，大尺度ECP的長期生存需要在體外形成微、中尺度血管，模擬復雜的多尺度血管。
圖4
克服擴散限制的血管化策略。微尺度毛細血管(b-d)和中尺度血管(e-f)的體外形成是厚心臟組織所必需的；微尺度毛細血管的體外形成依賴于內皮細胞(EC)的自組裝，其由血管新生和血管形成驅動(b)；微血管取向由拓撲結構重建或力學信號調節(c)；通過吸引周皮細胞和提供合適的力學環境促進微血管成熟(d)；單層血管的形成是通過在血管細胞存在時產生預先標記的通道或在EC播種后形成的(e)；通過同軸打印和擴散誘導凝膠化方法形成多層異質血管(圖f)。
圖5
工程化心肌組織中微尺度、中尺度血管構建方法。內皮細胞(EC)能夠自組裝成微毛細血管結構，由內皮細胞特異性PECAM-A(綠色)和DAPI(藍色)染色(a)；EC在VEGF梯度(紅色箭頭)下萌發成膠原支架，并用羅丹明-鬼筆環肽(黃色)和DAPI(藍色)染色。白色和無色箭頭分別表示與莖細胞相連和分離的尖端細胞(b)；機械約束條件下纖維蛋白凝膠中微毛細管取向，內皮細胞由紅色
hCD31標記，轉導周皮細胞由綠色熒光蛋白(GFP)標記，細胞核由藍色Hoescht標記(c)；與GelMA水凝膠中的血管周圍細胞共培養促進微毛細血管的成熟和穩定。其中內皮細胞由DsRed標記，表達αSMA的平滑肌細胞從間充質干細胞分化而來(d)；通過逐層組裝具有預先設計拓撲結構重建形狀的膠原水凝膠，形成可灌注血管通道。內皮細胞用CD31(紅色)和DAPI(藍色)染色(e)；在3D打印的易流變性Pluronic
F127模板上澆鑄載細胞水凝膠形成可灌注血管通道，通道內有HUVEC(紅色)襯里，周圍組織包裹有人類新生兒真皮成纖維細胞(HNDFs，綠色)(f)；使用載有EC的犧牲生物墨水3D打印微纖維，通過犧牲打印的方法制造血管化心臟心肌補片，用CD31(綠色)和肌動蛋白(粉紅色)染色(g)；通過犧牲打印策略形成血管通道，并用HUVECs(綠色)灌注(h)；用DMD立體光刻法直接制造血管化組織，HUVEC(紅色)封裝在通道中，HepG2細胞(綠色)封裝在周圍組織中(i)；利用光切除的方法在熒光素修飾的水凝膠(綠色)中生成仿生血管通道，并用熒光微珠(紅色)灌注(j)；通過同軸打印策略形成雙層血管(圖k)。
工程化心肌腔室(ECP)的成熟一方面，雖然微智造技術特別是3D打印技術能夠精確控制細胞和生物材料的空間沉積，以創建腔室的拓撲結構重建形狀，但工程化心肌腔室不能自動獲得天然心臟的功能。工程組織通常需要經過數周或數月的體外培養，通過細胞黏附、組織和基質沉積等方式完成組織形態形成和成熟。另一方面，多能干細胞的出現，包括胚胎干細胞(ESC)和誘導多能干細胞(iPSC)，為體外產生心肌細胞(CM)提供了有效的細胞來源，并且具有臨床規模的高通量和高純度。然而，干細胞分化的心肌細胞(PSC-CM)通常是不成熟的，其結構和功能特征類似于胎兒心肌細胞(約第十六周)，細胞和組織水平上的不成熟性已經極大地阻礙了其在心肌再生中的應用。例如，PSC-CM衍生的心臟心肌補片由于其獨立的、異質性的收縮活動可能改變宿主心肌的電傳播，從而導致致命的心律失常風險。迄今為止，通過模擬心臟發育過程中的體內環境，已經開發出多種策略來促進心臟工程組織的功能成熟(圖6)。本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟策略，并強調了它們在工程化心肌腔室成熟中的潛在作用。雖然目前大多數成熟策略都是通過二維培養模型、微尺度的類器官或心臟構建物來證明的，但這些成熟策略與血管化策略相結合，有潛力在更大尺度上應用于工程化心肌腔室的成熟。
圖6
模擬體內環境的體外成熟策略。在胎兒早期，胚胎心臟長成新月體，之后形成由心肌層和心內膜層組成的心管，兩者之間有果凍狀的細胞外基質。在胎兒晚期，心管通過折疊和旋轉成環，并在冠狀血管系統和傳導系統開始發育的同時轉變為腔室心臟。代謝改變、細胞外基質和非肌細胞相互作用以及機械和電刺激協同作用，促進CM從未成熟胎兒期向完全成熟成人期發育(a)；hiPSC心源性分化能夠得到成熟程度與早期胎兒CM相當hiPSC-CM。目前已建立了一套促進心臟工程組織體外成熟的生物工程方法，包括長期培養、生化誘導、與非肌細胞共培養、細胞-基質相互作用和生物物理刺激等(b)。
展望與總結
在過去的幾年里，具有復雜拓撲結構重建特性的宏觀ECP的制備策略和微尺度ECT的成熟策略取得了顯著的進展。隨著干細胞、生物材料和3D生物打印等技術的快速發展和融合交叉，功能性工程化心肌腔室的體外制造取得了長足的進步，人類有望迎來完整的人工心臟。本篇綜述討論了功能性工程化心肌腔室的一些主要挑戰和重要瓶頸，如與制造、血管化和成熟相關的問題。解決這些挑戰可以在很大程度上推進心臟修復和心臟疾病的體外建模的技術水平。除了這些瓶頸，其他關鍵的挑戰包括PSC-CM的成本效益和宏觀擴展、工程心肌與宿主心肌的電整合、宿主機體的免疫排斥、低溫保存和監管障礙等，需要在未來的臨床轉化中加以解決。
參考文獻
本文第一作者為清華大學機械系生物制造中心的博士后方永聰，通訊作者為清華大學機械系生物制造中心的熊卓副教授、張婷副研究員。
Fang Y, Sun W, Zhang T, Xiong Z. Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: A review. Biomaterials 2022;280:121298.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121298
(責任編輯：admin)
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