浙江大學王毅及賀永團隊：生物水凝膠微結構快速制造方法助力心肌細胞定向可控生長
時間：2022-09-14 14:02 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
生物水凝膠上的微/納米結構廣泛用于誘導細胞圖案化。傳統的光刻技術制造模具既耗時又昂貴，并且由于生物水凝膠軟脆的特性，過大的脫模力還極易導致微結構損壞。近期，EFL團隊與藥學院王毅教授合作提出了一種快速批量制造細胞圖案的新方法，使用高精度3D打印模具，通過揭示熱-光交聯固化機制，實現低濃度-低取代率的GelMA水凝膠微結構高質高效制造。利用該方法，可以穩定且低成本地制造特征尺寸為6-80μm任意定制的水凝膠圖案。在超軟水凝膠及高精度微結構的支持下，心肌細胞可實現每分鐘216次（BPM）的持續自發搏動，接近大鼠心臟的自然搏動速率（300
BPM）。這項工作為細胞圖案化提供了一個通用方案，能廣泛應用于組織修復、藥物測試篩選等領域。相關工作“Rapid and mass
manufacturing of soft hydrogel microstructures for cell patterns
assisted by 3D printing”近期發表在Bio-Design and
Manufacturing雜志上，浙大機械學院何超凡博士生與浙大藥學院王雪純博士為共同一作，浙大機械學院的賀永教授和藥學院的王毅教授為共同通訊作者。
材料與細胞的相互作用是組織工程和再生醫學的研究熱點之一。除了生化特性，材料表面的拓撲結構對細胞行為也有重要影響。許多研究表明，接近細胞大小的微/納米結構對細胞具有“接觸引導”效應，即細胞的生長方向與該結構趨于一致，這一效應已在許多細胞中得到驗證。然而，現有的細胞-基質相互作用研究大多基于生物相容性較差的材料，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、硅、石英等，其主要原因是高效高質制造軟脆水凝膠微結構仍然是一個很大的挑戰，低濃度-低取代率的水凝膠更是如此。本文采用高精度DLP打印工藝制造了超精密結構的模具，并翻模出軟的PDMS模具，與光刻技術相比設計靈活性及效率有較大提升。將GelMA溶液澆鑄在模具上進行熱-光交聯，與光交聯GelMA (PGelMA)相比，熱光交聯GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可調性的同時，更有彈性。其核心的機制是隨著溫度的降低，三螺旋結構（THS）的部分恢復會導致GelMA的溶液-凝膠化轉變。熱光交聯的凝膠TPGelMA，其力學性能的提高能大幅降低脫模過程中微結構的破壞。
圖1 軟脆水凝膠微結構制造方法
為驗證三螺旋結構（THS）對GelMA水凝膠性能的影響，比較了EFL-GM30、GM60、GM90三種典型取代率GelMA的CD光譜。這三條線在198 nm附近都有一個負峰，與膠原蛋白類似。峰幅值隨著取代率的增加而減小，說明MA基團的引入破壞了明膠鏈上原有的氨基酸序列，阻礙了THS的形成。GM30在不同溫度下的CD光譜也顯示，隨著溫度的降低，促進了THS的形成。FTIR分析顯示，TPGelMA光譜的峰值更高，頻率也發生了顯著變化，這與氫鍵數量的增加密切相關。在機械強度方面，TPGelMA的楊氏模量和抗拉強度均明顯高于PGelMA。隨著取代率的增加，強度增加比逐漸降低，說明MA基團的引入阻礙了THS的形成，這與CD光譜的結果一致。兩種GelMA在不同溶劑中的體積變化率也不同。結果表明，TPGelMA在去離子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的體積變化明顯小于PGelMA，表明TPGelMA的分子網絡更致密。
圖2 熱-光交聯水凝膠的性能
水凝膠潮濕、軟脆的特性使其力學數據難以準確測量。到目前為止，對水凝膠力學性能的研究大多僅限于壓縮試驗上。為解決這一問題，我們設計了一系列實驗方案，以準確獲取水凝膠拉伸、壓縮、剪切、黏附等各種力學數據。并在此基礎上，建立了水凝膠在脫模過程中的粘附和損傷模型。拉伸試驗結果表明，TPGelMA的楊氏模量、抗拉強度和斷裂伸長率顯著提高。當應變達到200%后，應力-應變曲線斜率明顯增大，為“應變硬化”效應。這種現象并沒有發生在PGelMA中。在整個拉伸過程中，PGelMA的應力-應變曲線始終是線性的。這可能是因為其分子網絡比較松散，在分子鏈取向趨于一致之前就斷裂了。在剪切實驗中，TPGelMA也表現出更好的力學性能。而在粘附實驗中，TPGelMA的粘附強度雖然也有所增加，但增加幅度遠低于拉伸和剪切強度的增加幅度，這也是TPGelMA能避免脫模損傷的重要原因。
圖3 水凝膠機械性能測試方案與損傷模型
材料與細胞的相互作用是組織工程和再生醫學的研究熱點之一。除了生化特性，材料表面的拓撲結構對細胞行為也有重要影響。許多研究表明，接近細胞大小的微/納米結構對細胞具有“接觸引導”效應，即細胞的生長方向與該結構趨于一致，這一效應已在許多細胞中得到驗證。然而，現有的細胞-基質相互作用研究大多基于生物相容性較差的材料，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、硅、石英等，其主要原因是高效高質制造軟脆水凝膠微結構仍然是一個很大的挑戰，低濃度-低取代率的水凝膠更是如此。本文采用高精度DLP打印工藝制造了超精密結構的模具，并翻模出軟的PDMS模具，與光刻技術相比設計靈活性及效率有較大提升。將GelMA溶液澆鑄在模具上進行熱-光交聯，與光交聯GelMA (PGelMA)相比，熱光交聯GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可調性的同時，更有彈性。其核心的機制是隨著溫度的降低，三螺旋結構（THS）的部分恢復會導致GelMA的溶液-凝膠化轉變。熱光交聯的凝膠TPGelMA，其力學性能的提高能大幅降低脫模過程中微結構的破壞。
圖1 軟脆水凝膠微結構制造方法
為驗證三螺旋結構（THS）對GelMA水凝膠性能的影響，比較了EFL-GM30、GM60、GM90三種典型取代率GelMA的CD光譜。這三條線在198 nm附近都有一個負峰，與膠原蛋白類似。峰幅值隨著取代率的增加而減小，說明MA基團的引入破壞了明膠鏈上原有的氨基酸序列，阻礙了THS的形成。GM30在不同溫度下的CD光譜也顯示，隨著溫度的降低，促進了THS的形成。FTIR分析顯示，TPGelMA光譜的峰值更高，頻率也發生了顯著變化，這與氫鍵數量的增加密切相關。在機械強度方面，TPGelMA的楊氏模量和抗拉強度均明顯高于PGelMA。隨著取代率的增加，強度增加比逐漸降低，說明MA基團的引入阻礙了THS的形成，這與CD光譜的結果一致。兩種GelMA在不同溶劑中的體積變化率也不同。結果表明，TPGelMA在去離子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的體積變化明顯小于PGelMA，表明TPGelMA的分子網絡更致密。
圖2 熱-光交聯水凝膠的性能
水凝膠潮濕、軟脆的特性使其力學數據難以準確測量。到目前為止，對水凝膠力學性能的研究大多僅限于壓縮試驗上。為解決這一問題，我們設計了一系列實驗方案，以準確獲取水凝膠拉伸、壓縮、剪切、黏附等各種力學數據。并在此基礎上，建立了水凝膠在脫模過程中的粘附和損傷模型。拉伸試驗結果表明，TPGelMA的楊氏模量、抗拉強度和斷裂伸長率顯著提高。當應變達到200%后，應力-應變曲線斜率明顯增大，為“應變硬化”效應。這種現象并沒有發生在PGelMA中。在整個拉伸過程中，PGelMA的應力-應變曲線始終是線性的。這可能是因為其分子網絡比較松散，在分子鏈取向趨于一致之前就斷裂了。在剪切實驗中，TPGelMA也表現出更好的力學性能。而在粘附實驗中，TPGelMA的粘附強度雖然也有所增加，但增加幅度遠低于拉伸和剪切強度的增加幅度，這也是TPGelMA能避免脫模損傷的重要原因。
圖3 水凝膠機械性能測試方案與損傷模型
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