生物打印人體膠質母細胞瘤芯片以鑒定患者對放化療的特異性反應
時間：2020-02-17 10:46 來源：南極熊 作者：中國3D打印網 閱讀：次
膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的腦瘤，約占所有原發性惡性腦瘤的50%，具有很高的致死率。為了給患者制定一套有效的治療方案，建立患者特定的癌癥模型是一種可靠的臨床決策選擇。病人來源的腫瘤異種移植動物模型已被證明能很好地再現親代腫瘤的特征，但由于建立腫瘤模型所需的時間長、成功率低、成本高和倫理問題，它們在臨床上的試驗受到了阻礙。而建立反映父代癌癥原始信息的體外腫瘤模型可以克服這些不利因素。目前，體外腫瘤模型在建立一個包括細胞和分子多樣性以及腫瘤的生化和生物物理信號的生理相關系統方面仍然存在一定的局限性。
因此，Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團隊提出了一種制作具有高度仿生生態系統的體外腫瘤模型的方法-GBM芯片。該GBM芯片通過生物3D打印來自患者來源的腫瘤細胞（GBM）、血管內皮細胞（HUVECs）的生物墨水（BdECM）制作。經過后續的實驗探究，該芯片的高度異質性促成了GBM各種病理特征的出現，與臨床結果相匹配。并且患者特異性的GBM芯片模型可用于試驗優越腫瘤殺傷相關的藥物組合，可能有助于確定對標準治療膠質母細胞瘤藥物耐藥的患者的有效治療方法。
近期發表在Nature Biomedical Engineering雜志上題為”A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chipfor the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy”的文章，來自首爾國立大學的Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團隊。
為了打印GBM模型芯片，研究團隊首先開發了一種豬腦脫細胞化的生物墨水（BdECM）。生物墨水在打印時起到保護細胞的封裝載體作用，并在沉積后凝固成為細胞支撐基質。為了評估這種生物墨水在促進GBM細胞惡性增殖方面的潛力，將其與常用的膠原凝膠進行對比。團隊成員將GBM細胞進行水凝膠包埋培養，以模擬細胞在三維生物打印過程后以膠囊形式生長。最終結果表明，BdECM中具有更加優越的細胞增值率、相關基因的高表達以及紡錘狀的細胞形態（圖2）。
然后，根據GBM的生態學特征【GBM以高度致密的球形生長，沿氧梯度形成解剖上不同的區域（核心、中間和外圍）。核心區中的癌細胞經歷嚴重的缺氧，并形成假透明帶的壞死區。在中間區，間變性細胞過度增殖，分泌多種細胞因子以維持生存。結果，腫瘤周圍區域出現微血管浸潤和增生】，打印GBM芯片。芯片的制作過程如下（輔助視頻1）：（1）在非滲透性玻璃基板上用可滲透硅樹脂墨水打印腔室壁；（2）為了構建GBM模擬結構，首先將填充HUVECs的BdECM生物墨水打印成環狀；（3）然后打印含有GBM細胞的BdECM生物油墨，填充BdECM-HUVEC環結構的內部，（4）將整個打印結構固化在加濕細胞培養箱中，然后用玻璃蓋片覆蓋腔室頂部（圖3）。另外，通過有限元分析計算結合免疫熒光染色法實驗，表征了芯片的氧梯度。
由于芯片上的GBM同時捕獲了原始癌癥環境的三個關鍵特性：生化特征（類似于腦ECM的微環境）和兩個物理特征（癌性腫塊的分隔結構，血管化基質和氧梯度）。通過比較不同的環境特征組合即單元類型（SF+,SF-）、氧梯度(GR+,GR-)，我們評估了這些特性對GBM病理生理學重述的影響（圖4）。通過實驗表征，SP+ GR+條件（單元化結構、存在氧梯度）比其他條件更能反映腫瘤的重要病理學特征，包括缺氧誘導的壞死核、假柵欄、細胞類型的空間異質性和血管周圍微環境。這些數據再次支持了BdECM，氧梯度和分隔的組織結構的協同效應對于概括原始GBM病理生理的重要性。
接下來，團隊成員利用GBM芯片再現了GBM患者由于藥物抵抗力差異所導致的差異性臨床治療結果的現象。患者在經過同步放化療（CCRT）加替莫唑胺（TMZ）【標準治療療程】治療后的不同結果分為3組，即X組患者（a、b和c）表現出低到中等的治療抵抗力，存活時間>2年；Y組患者（d和e）表現出高的治療抵抗力，存活時間<1年，Z組患者（f組和g組）在CCRT后經歷了惡性腫瘤。鑒于這些臨床結果，利用上述患者來源的GBM細胞制成上述芯片，經過單次CCRT和TMZ治療。有趣的是，X組芯片上的GBM-15、-26和-278細胞的存活率低于其他組，而Z組芯片上的GBM-28、-37、-51和-103細胞的存活率顯著高于其他組（圖5），單次治療后從芯片上GBMs獲得的存活率百分比的順序為X
最后，團隊成員研究了GBM芯片針對特定患者的藥物組合效果評價。由于患者c在接受CCRT后病情意外惡化，利用該芯片篩選幾種候選藥物組合治療效果（圖6），并以此確定了相對最佳的治療方案。
圖6 評估單個患者對用不同的藥物組合配合CCRT治療的敏感性
因此，Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團隊提出了一種制作具有高度仿生生態系統的體外腫瘤模型的方法-GBM芯片。該GBM芯片通過生物3D打印來自患者來源的腫瘤細胞（GBM）、血管內皮細胞（HUVECs）的生物墨水（BdECM）制作。經過后續的實驗探究，該芯片的高度異質性促成了GBM各種病理特征的出現，與臨床結果相匹配。并且患者特異性的GBM芯片模型可用于試驗優越腫瘤殺傷相關的藥物組合，可能有助于確定對標準治療膠質母細胞瘤藥物耐藥的患者的有效治療方法。
近期發表在Nature Biomedical Engineering雜志上題為”A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chipfor the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy”的文章，來自首爾國立大學的Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho團隊。
圖1 用于為病人識別最佳藥物組合的專用GBM芯片的生物打印和使用示意圖。
為了打印GBM模型芯片，研究團隊首先開發了一種豬腦脫細胞化的生物墨水（BdECM）。生物墨水在打印時起到保護細胞的封裝載體作用，并在沉積后凝固成為細胞支撐基質。為了評估這種生物墨水在促進GBM細胞惡性增殖方面的潛力，將其與常用的膠原凝膠進行對比。團隊成員將GBM細胞進行水凝膠包埋培養，以模擬細胞在三維生物打印過程后以膠囊形式生長。最終結果表明，BdECM中具有更加優越的細胞增值率、相關基因的高表達以及紡錘狀的細胞形態（圖2）。
圖2 BdECM生物墨水的制備與評價
然后，根據GBM的生態學特征【GBM以高度致密的球形生長，沿氧梯度形成解剖上不同的區域（核心、中間和外圍）。核心區中的癌細胞經歷嚴重的缺氧，并形成假透明帶的壞死區。在中間區，間變性細胞過度增殖，分泌多種細胞因子以維持生存。結果，腫瘤周圍區域出現微血管浸潤和增生】，打印GBM芯片。芯片的制作過程如下（輔助視頻1）：（1）在非滲透性玻璃基板上用可滲透硅樹脂墨水打印腔室壁；（2）為了構建GBM模擬結構，首先將填充HUVECs的BdECM生物墨水打印成環狀；（3）然后打印含有GBM細胞的BdECM生物油墨，填充BdECM-HUVEC環結構的內部，（4）將整個打印結構固化在加濕細胞培養箱中，然后用玻璃蓋片覆蓋腔室頂部（圖3）。另外，通過有限元分析計算結合免疫熒光染色法實驗，表征了芯片的氧梯度。
圖3 GBM芯片打印原理以及生態學表征
由于芯片上的GBM同時捕獲了原始癌癥環境的三個關鍵特性：生化特征（類似于腦ECM的微環境）和兩個物理特征（癌性腫塊的分隔結構，血管化基質和氧梯度）。通過比較不同的環境特征組合即單元類型（SF+,SF-）、氧梯度(GR+,GR-)，我們評估了這些特性對GBM病理生理學重述的影響（圖4）。通過實驗表征，SP+ GR+條件（單元化結構、存在氧梯度）比其他條件更能反映腫瘤的重要病理學特征，包括缺氧誘導的壞死核、假柵欄、細胞類型的空間異質性和血管周圍微環境。這些數據再次支持了BdECM，氧梯度和分隔的組織結構的協同效應對于概括原始GBM病理生理的重要性。
圖4 生化和生物物理異質性對芯片上GBM病理進展的協同效應。
接下來，團隊成員利用GBM芯片再現了GBM患者由于藥物抵抗力差異所導致的差異性臨床治療結果的現象。患者在經過同步放化療（CCRT）加替莫唑胺（TMZ）【標準治療療程】治療后的不同結果分為3組，即X組患者（a、b和c）表現出低到中等的治療抵抗力，存活時間>2年；Y組患者（d和e）表現出高的治療抵抗力，存活時間<1年，Z組患者（f組和g組）在CCRT后經歷了惡性腫瘤。鑒于這些臨床結果，利用上述患者來源的GBM細胞制成上述芯片，經過單次CCRT和TMZ治療。有趣的是，X組芯片上的GBM-15、-26和-278細胞的存活率低于其他組，而Z組芯片上的GBM-28、-37、-51和-103細胞的存活率顯著高于其他組（圖5），單次治療后從芯片上GBMs獲得的存活率百分比的順序為X
圖5 患者特異性GBM芯片治療耐藥性差異的臨床再現
最后，團隊成員研究了GBM芯片針對特定患者的藥物組合效果評價。由于患者c在接受CCRT后病情意外惡化，利用該芯片篩選幾種候選藥物組合治療效果（圖6），并以此確定了相對最佳的治療方案。
圖6 評估單個患者對用不同的藥物組合配合CCRT治療的敏感性
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