心臟瓣膜置換術有許多問題，如鈣化、炎癥和內皮化受限。為此，南京工業大學遲波教授及其團隊對以生物可降解的精氨酸修飾的聚賴氨酸和氧化透明質酸為底物，擴大了醛和氨基在生理條件下快速席夫堿反應形成動態酰肼鍵的優勢。這些材料被用于設計動態自適應水凝膠，以及一個模擬細胞外基質的多糖/蛋白質雙網絡系統，實現了其水凝膠優異的機械可調性和剪切減薄性能。該雙重抗菌機制有效地避免了瓣膜植入術后感染樣炎癥的發生。該水凝膠具有很強的促進細胞增殖的能力，也可以通過一種潛在的細胞招募機制促進細胞遷移。水凝膠在體內動態觸發和維持NO的釋放，根據需要去除炎癥部位高表達的ROS。它進一步促進血管生成，并為氧化應激信號引起的鈣化主動脈瓣疾病提供靶向治療。此外，它具有特殊的抗鈣化特性，可以增強CD31的上調，同時抑制IL-10和TNF-α的表達，從而顯著促進血管生成，減少炎癥反應。此外，3D打印技術還可以對具有不同異構結構的閥門進行個性化定制，以實現高度的仿生組織。

      相關研究成果以“ 3D Printed Heart Valve mediated Nitric Oxide Sustained Release reduced potential for calcification and inflammatory Capacity”為題于2023年6月4日發表在《Chemical Engineering Journal》上。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.143892

     本研究建立了多糖/蛋白質動態自適應水凝膠系統，基于動態化學鍵和物理動力學的聚賴氨酸和透明質酸實現其特定的生理功能（圖1a）。本研究充分利用聚賴氨酸和透明質酸的簡單化學修飾，通過精氨酸羧基與聚賴氨酸游離氨基之間的化學酰胺化反應制備功能化聚賴氨酸（PA）和氧化透明質酸（HC）（圖1b）。比較精氨酸和聚賴氨酸的核磁共振氫譜數據，可以清楚地看到PA顯示出與精氨酸在1.48 ppm、1.60 ppm、3.03pppm和3.61 ppm相似的氫質子信號（圖1c）。HC在5.0- 5.5 ppm時也顯示出與HA不同的氫質子吸收峰（圖1d）。

圖1 功能動態互滲透水凝膠的制備、關鍵高分子材料的制備及表征

圖2 功能動態互穿水凝膠的不同交聯策略和力學性能的評價

    在制備的活性聚合物的基礎上，利用生理條件下醛基和氨基的席夫堿化學反應制備了具有組織適應性特性的動態HAP活水凝膠（圖2a）。為了匹配水凝膠支架的機械強度和天然閥門組織，通過引入PEGDA交聯劑，形成了一個動態雙交聯水凝膠互穿網絡（圖2b），然后分散碳納米管支架在此基礎上產生良好的電傳導的水凝膠支架（圖2c）。采用應力掃描實驗對不同類型水凝膠的力學模量進行了評價（圖2d-g）。隨著PA和HC聚合物濃度的增加，HAP水凝膠的儲能模量呈上升趨勢，其頻率掃描實驗也呈現出相同的趨勢（圖2h、i）。在互穿小分子PEGDA的存在下，其機械模量呈明顯的增加趨勢，儲能模量約為損失模量的10倍（圖2l、m）。同樣，導電材料碳納米管(CNT)的引入也表現出相同的趨勢（圖2n、o）。由于存在弱動態席夫堿鍵和互穿的交聯網絡，因此它具有良好的能量耗散機制（圖2r）。雖然添加不同濃度的CNT并沒有顯著改變水凝膠材料的機械強度（圖2s），但由于CNT親和性的限制，水凝膠網絡的能量耗散機制顯著降低（圖2t）。因此，需要進一步確定碳納米管的含量，以保持其機械強度而不斷裂，同時保持其良好的電轉移打印性能。

圖3 功能動態互穿水凝膠的動態適應性、導電性和光熱特性的評價

它具有良好的應力恢復性能（圖3a、b），由于席夫堿鍵在應力條件下的斷裂復合（圖3c）。在實驗中，通過評價水凝膠的電導率后，水凝膠的電導率顯著提高（圖3d）。紫外-可見光譜證實，隨著CNT濃度的增加，水凝膠網絡的親和力顯著降低，特別在孵育液中顯示為明顯的游離CNT（圖3f）。此外，溶液的吸光度值也增加了（圖3g），隨著孵育時間的延長，高濃度CNT的親和力急劇降低（圖3h、i）。CNT在808 nm的紅外激光照射下也表現出了良好的光熱效應（圖3l），隨著輻照時間的延長，CNT水凝膠中心點的溫度升高（圖3j、k）。因此，該導電水凝膠支架的應用將實現血流動力學的多次實時監測，對人工心臟瓣膜的臨床應用具有深遠的意義。

圖4 功能動態互穿水凝膠的理化結構表征

與純動態交聯的HAP水凝膠相比，PEGDA水凝膠具有明顯的抗溶脹行為，而CNT水凝膠具有相同的性能（圖4a、e）。然而，隨著CNT濃度的增加，CNT水凝膠的溶脹率顯著增加（圖4b、f）。隨著體系中PEGDA的引入，水凝膠的交聯法增加了共價鍵的維持，溶脹率從120%下降到60%，降解時間從84小時增加到770小時（圖4c、g）。引入不同濃度的CNT后，發現隨著CNT濃度的增加，水凝膠體系的穩定性有不同程度的降低，導致其降解時間有顯著差異（圖4d、h）。通過不同類型的水凝膠支架的顯微圖像可以看出，純動態交聯的HAP水凝膠呈現出一個層狀多孔結構（圖4i）。隨著PEGDA和CNT的引入，水凝膠的整體孔徑變厚，網絡結構變密（圖4j、k）。此外，激光照射后的CNT水凝膠并不影響水凝膠支架的物理結構（圖4l）。因此，這種基于水凝膠的松散多孔支架材料將有助于細胞的存活和分化，促進瓣膜支架的內皮化，提高人工生物瓣膜支架的臨床應用。

圖5 功能動態互穿水凝膠的3D打印性能和細胞封裝性能

構建的水凝膠油墨都表現出良好的剪切稀釋性能（圖5a）。增加的水凝膠交聯網絡增加了注射壓力，但擠壓效應沒有受到影響（圖5b）。隨著注入速度的調整，也不受水凝膠油墨的注入壓力的影響（圖5c）。然后，利用擠出光固化打印機構建心臟瓣膜模型（圖5d、f），并成功制備了閥門形狀的3D打印樣品（圖5e、g）。由于醛基和氨基的動態變化，具有剪切稀釋特性的水凝膠油墨在膜打印過程中也可以保護細胞免受剪切力的損傷（圖5h）。與DMEM相比，水凝膠包封的細胞顯示出更高的細胞活力（圖5i）和活細胞數量（圖5j），這有助于后期構建包含細胞的集成打印策略。

圖6 功能動態互滲水凝膠在體外促進NO產生的評價

使用精氨酸作為NO釋解劑，在體內NO酶的作用下可以產生NO氣體（圖6a）。與空白對照組相比，實驗組的水凝膠顯示出較強的顏色變化（圖6b）。近300小時后，NO在一個釋放周期內實現了持續和穩定的釋放（圖6c），而NO的飽和釋放隨著PA濃度的增加而增加，并且隨著水凝膠支架結構穩定性的進一步提高，這種優良的NO生成能力并沒有相應的變化（圖6d）。通過評估整個釋放周期中NO的釋放速率（圖6e），由于水凝膠交聯密度和結構穩定性的影響，NO在單一交聯動態水凝膠中的釋放速率大約是結構穩定的水凝膠的14倍。隨著水凝膠的進一步增強，NO在體系中的釋放速率顯著降低，但沒有顯著差異（圖6f）。與對照組相比，將生物基水凝膠材料與細胞共培養后，水凝膠實驗組在細胞中表現出更強的熒光信號（圖6g）。通過將水凝膠支架與慢釋放NO氣體共培養來評估其促血管生成的能力，實驗結果證實水凝膠支架具有顯著的促血管生成能力（圖6h）。

圖7 功能動態互穿水凝膠的體外抗氧化性能的評價

水凝膠的抗氧化性能在2小時內迅速增加并達到峰值（圖7a），而DPPH的清除作用隨著PA濃度的增加而增強（圖7b）。溶液的顏色也逐漸褪色和褪色（圖7c）。雖然PEGDA和CNT的引入延遲了自由基的清除效率，但它們在12小時內都達到了最大水平（圖7d），但沒有顯著差異（圖7e）。在400-700 nm處的全波長掃描也得到了相同的結果（圖7f）。同樣，本研究制備的水凝膠體系對過氧化氫也有相同的清除作用（圖7g-i）。與對照組相比，將生物基水凝膠材料與細胞共培養后，水凝膠組清除活性氧的能力更好，而精氨酸修飾提高了這種能力（圖7j）。鑒于該水凝膠材料在ROS清除實驗中具有良好的反應性，有望用于主動脈瓣支架的構建，以改善病變的炎癥反應，促進瓣膜組織的修復和重建。

圖8 功能動態互穿水凝膠的生物安全性評價

本研究采用CCK-8進行定量、定性檢測細胞相容性。結果顯示，水凝膠組與對照組相比，具有更高的細胞存活率，保持在110%以上（圖8a），形態學特征無明顯差異（圖8b）。同時，其溶血率較低（圖8c)。隨著碳納米管的引入，蛋白質吸附率呈上升趨勢，一般保持在10%（圖8d），熒光染色顯示，與HAP水凝膠組相比，其他實驗組FITC的熒光信號明顯減弱（圖8e），具有抗蛋白粘附能力，有利于減少血栓形成等并發癥。

圖9 功能動態互穿水凝膠體外細胞招募能力的評價

為了模擬心臟瓣膜支架植入對內源性細胞行為的影響因素，采用細胞劃痕和跨孔實驗進行評價。圖9a、b中的劃痕試驗結果顯示，水凝膠組的細胞遷移率整體上高于對照組。利用transwell室構建水凝膠和細胞共培養體系（圖9c），發現凝膠組的細胞遷移數量高于對照組（圖9d、e），表明該水凝膠支架具有優良的生物學特性，促進NO產生的能力可以促進細胞遷移，將內源性細胞招募到瓣膜部位，加速組織整合和再內皮化。

圖10 抗炎行為

圖11 大鼠功能動態互穿水凝膠生理功能的驗證

體外實驗證實，與巨噬細胞共培養后，與對照組相比，許多巨噬細胞失活（圖10a）。隨著時間的推移，GLUT組在第30天仍表現出嚴重的組織炎癥，而水凝膠實驗組的炎癥水平明顯下調（圖10 b、c）。IL-10和TNF-α抗體的免疫組化染色（圖10 d-g）證實，所有植入的材料隨著時間的推移都表現出不同程度的炎癥下調（圖11a、b）。將水凝膠支架植入大鼠皮下組織，然后進行H&E染色（圖11c）和CD31免疫組化染色（圖11d），顯示廣泛的血管生成，與GLUT無明顯相關性，茜素紅染色分析（圖11e）顯示，GLUT組有大量鈣化沉積物，而水凝膠植入物只有少量的沉積物。水凝膠組具有良好的抗炎性和清除ROS的活性，并具有較強的抗鈣化潛力，為瓣膜性鈣化疾病的預防和治療提供了一種新的治療方法。

© 3D科學谷

綜上所述，本研究提供了一種抗菌水凝膠，可以釋放NO、去除ROS、促進血管生成，以解決各種術后并發癥，如鈣化、血栓形成、炎癥和有限的再內皮化。本研究采用L-精氨酸功能化的天然抗菌聚合物聚賴氨酸和透明質酸氧化鈉形成單一的交聯動態交聯網絡。采用聚乙二醇二丙烯酯構建互滲透雙網絡系統，實現水凝膠在保持其機械強度的同時發揮生理作用，保證移植后瓣膜的壽命。此外，它還具有優良的剪切減薄特性，并可以通過3D增材制造技術來模擬構建人工心臟瓣膜支架。CNT摻入在808 nm激光照射后與聚賴氨酸產生雙重協同抗菌作用，有效避免瓣膜植入后感染和炎癥反應的發生。體外生物學實驗證實，該水凝膠在促進細胞遷移、抑制炎癥細胞增殖、抵抗蛋白粘附等方面具有良好的生物活性。水凝膠可以動態觸發體內一氧化氮酶的連續釋放，并刪除活性氧高表達的炎癥部位，參與生物瓣膜的再內皮化，下調炎癥因子的表達，直接靶向治療ROS介導的氧化應激信號減少腔鈣化。此外，通過體內植入實驗證實了其具有良好的組織適應性、促血管生成和抗鈣化能力。然而，由于水凝膠材料、機械強度、降解率、打印工藝等方面的限制，很難構建一個高度模仿天然瓣膜組織的瓣膜支架，但仍需要實現瓣膜組織的個人需求，改善手術結果。其效果具有長期的臨床應用意義。

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