臨界尺寸骨缺損的再生是臨床難題，僅促進成骨不足，血管和神經支配對建立骨再生微環境至關重要，但現有支架多無法實現三者協同再生，且缺乏持續可控的釋放模式。傳統3D生物打印技術在構建三維組織修復支架方面存在局限性，且多數生長因子在促進骨再生的同時，難以兼顧神經和血管的生長調控。   
      來自首都醫科大學附屬北京口腔醫院的白玉興教授、張珂教授合作開發了3D生物打印水凝膠微纖維（aMF）包埋人牙周膜干細胞（hPDLSCs）的三培養體系（含hPDLSCs、人臍靜脈內皮細胞hUVECs和周細胞PCs），并將其整合到磷酸鈣水泥（CPC）支架中，構建了二甲雙胍雙階段釋放系統。該系統通過第一階段CPC釋放二甲雙胍招募內源性細胞建立初步微環境，第二階段aMF降解后釋放細胞與藥物，促進三培養細胞互作及血管神經生成。實驗證明，該支架顯著提升骨、血管、神經再生量（分別為對照組2.5倍、3倍、3.5倍），其機制與TRIM26基因調控的信號通路相關。    
相關工作以“3D-printed microfibers encapsulating stem cells in scaffold with tri-culture and two-stage metformin release for bone/vasculature/nerve regeneration in rats”為題發表在《Bioactive Materials》上。
 

圖1.研究設計示意圖。(A) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架已證明能夠修復臨界尺寸骨缺損。(B) 3D 生物打印 aMF-CPC 支架可促進骨骼、血管化和神經組織修復。(C) 基于 3D 生物打印人牙周膜干細胞（hPDLSCs）的三培養系統，該系統以 hPDLSCs 為基礎，包含人臍靜脈內皮細胞（hUVECs）和周細胞（PCs）。(D) 包含三培養細胞的長入血管橫截面圖示。(E) 三培養系統內發生的復雜相互作用動態。

1. 3D生物打印微纖維-磷酸鈣水泥支架的設計與表征，通過FRESH技術與紫外固化工藝，制備了包埋人牙周膜干細胞（hPDLSCs）、人臍靜脈內皮細胞（hUVECs）和周細胞（PCs）的三培養體系支架，并整合二甲雙胍雙階段釋放系統。利用掃描電子顯微鏡（SEM）、傅里葉紅外光譜（FTIR）和原子力顯微鏡（AFM）分析支架結構，結果顯示其降解后形成100–300 μm大孔，力學性能（彎曲強度、彈性模量）優于松質骨，且二甲雙胍在CPC（階段一）和微纖維（aMF，階段二）中實現持續釋放，12天內累計釋放率達85%。      
 

2. 三培養體系的體外細胞行為與成骨分化，通過免疫熒光染色（PECAM1、Desmin）和活/死細胞染色，觀察三培養細胞在微纖維中的分布與增殖。CCK-8實驗顯示，細胞比例為hPDLSCs:hUVECs:PCs=4:12:1時增殖活性最佳，堿性磷酸酶（ALP）活性和茜素紅染色（ARS）礦化結節量在200 mg/mL二甲雙胍作用下顯著提升，成骨基因（ALP、Runx2）表達上調2–3倍，證實三細胞互作協同促進成骨與血管生成。      
 

3. 細胞比例優化與體外成骨活性對比，通過設置不同hPDLSCs:hUVECs:PCs比例（如4:12:1、1:3:1），結合ALP染色和ARS礦化結節分析，篩選出最佳三培養比例為4:12:1，該比例下細胞成骨分化活性最高，礦化結節面積較單一培養組增加3.5倍，表明細胞間相互作用對再生效果至關重要。      
 

4. 體內骨缺損修復與血管神經再生評估，在大鼠顱骨5 mm缺損模型中植入支架，通過Micro-CT、HE染色、Masson染色及免疫組化（CD31、CGRP）分析。結果表明，術后12周時，三培養+雙階段二甲雙胍組的新生骨體積/組織體積（BV/TV）為陰性對照組的2.5倍，血管密度（CD31+）和神經纖維密度（CGRP+）分別提升3倍和3.5倍，炎癥因子IL-1β、TNF-α表達降低60%以上，顯示支架顯著促進骨、血管、神經協同再生。      
 

5. TRIM26基因調控機制與信號通路解析，運用RNA測序和蛋白質免疫印跡（Western blot），發現二甲雙胍顯著上調TRIM26基因表達（log2FC=1.8），激活cAMP-MAPK通路并促進Runx2蛋白表達。抑制或敲低TRIM26后，成骨和血管生成相關指標顯著下降，證實TRIM26是調控三組織再生的關鍵因子，其機制與神經營養因子通路協同作用相關。      
 

研究結論
本研究開發了基于人牙周膜干細胞的三培養體系，并構建了3D生物打印微纖維-磷酸鈣水泥（aMF-CPC）支架，實現了二甲雙胍的雙階段釋放及骨、血管、神經組織的協同再生。實驗表明，該支架通過三培養細胞間的復雜相互作用（hPDLSCs、hUVECs、PCs），顯著提升了成骨、血管生成和神經支配能力：與陰性對照組相比，術后12周新生骨量增加2.5倍，血管和神經 ingrowth 分別提升3倍和3.5倍。機制研究發現，E3泛素連接酶TRIM26通過調控cAMP-MAPK信號通路參與這一過程。此外，支架具備良好的生物相容性、力學穩定性及可控降解特性，為顱骨等臨界尺寸骨缺損的修復提供了新策略，在口腔頜面及骨科再生領域具有潛在應用價值。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.05.011

(責任編輯：admin)

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