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《Biofabrication》:利用明膠和脫細(xì)胞骨顆粒組成的生物墨水進(jìn)行細(xì)胞打印

時(shí)間:2024-03-28 09:09 來源:EngineeringForLife 作者:admin 閱讀:
       生物制造應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)之一是如何獲得能在可打印性、形狀保真度、細(xì)胞活力和組織成熟度之間取得平衡的生物墨水。脫細(xì)胞方法可以提取天然細(xì)胞外基質(zhì),保留組織特異性基質(zhì)蛋白。然而,骨骼脫細(xì)胞的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于如何保留有機(jī)成分(膠原蛋白、蛋白聚糖)和無機(jī)成分(羥基磷灰石),以保持骨骼的天然成分和功能。此外,有必要研究脫細(xì)胞骨(DB)顆粒作為一種基于組織的添加劑在生物墨水配方中的作用,以開發(fā)功能性生物墨水。
      來自土耳其伊茲密爾理工學(xué)院的Aylin Kara Özenler 團(tuán)隊(duì)與來自德國埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)的Aldo R Boccaccini團(tuán)隊(duì)評估了在含有明膠(GEL)和前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)或人間充質(zhì)干細(xì)胞(hTERT-MSCs)的生物墨水配方中加入不同大小(≤45 和 ≤100 μm)和濃度(1%、5%、10%(重量百分比))的脫細(xì)胞骨顆粒的效果。此外,本研究還提出了一種使用明膠、DB 顆粒和細(xì)胞的簡易生物墨水配方,其制備過程簡單,細(xì)胞存活率高。本研究對油墨的打印性能進(jìn)行了評估。此外,還通過剪切稀化和觸變性測試確定了流變特性。生物打印結(jié)構(gòu)經(jīng)過 28 天的培養(yǎng)。使用生化分析和熒光顯微鏡評估了細(xì)胞的活力、增殖和成骨分化能力。DB 顆粒的加入增強(qiáng)了細(xì)胞增殖和成骨分化能力,這可能是由于 DB 顆粒含有天然膠原蛋白和羥基磷灰石。使用 DB 粒子后,堿性磷酸酶活性顯著增加,特別是在沒有誘導(dǎo)細(xì)胞成骨的情況下。此外,熒光圖像顯示了細(xì)胞與材料之間明顯的相互作用以及細(xì)胞在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的附著。有了這些充滿希望的結(jié)果,目前的簡易生物墨水配方被認(rèn)為是骨組織工程的潛在候選材料,它是一種可用于臨床的材料,制備簡單,細(xì)胞活性高。相關(guān)工作以題為“3D bioprinting of mouse pre-osteoblasts and human MSCs using bioinks consisting of gelatin and decellularized bone particles”的文章發(fā)表在2024年03月13日的國際知名期刊《Biofabrication》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容

本研究的目的是開發(fā)一種由凝膠、DB 顆粒和細(xì)胞組成的最小化生物墨水配方,并評估凝膠基質(zhì)中不同大小和濃度的 DB 顆粒對細(xì)胞行為的影響。研究示意圖如圖 1 所示。在之前的研究中,發(fā)現(xiàn) DB 粒子和 GEL 組合作為生物材料墨水對 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞有利。本研究用小鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞(hTERT-MSCs)測試了 GEL/DB 復(fù)合生物墨水配方。在凝膠基質(zhì)中加入了不同大小和濃度的 DB 粒子,以獲得可打印的配方,同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的行為。正如本研究之前所報(bào)道的,100 微米的顆粒大小會降低較高顆粒濃度下的可打印性,因此,本研究的假設(shè)是,減小顆粒大小可能會增加可打印性,而且細(xì)胞行為也會隨著 DB 顆粒濃度的增加而增加。因此,本研究在兩種不同細(xì)胞類型的生物墨水配方中評估了不同大小的 DB 粒子的效果。通過與 mTG 交聯(lián),3D生物打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得以保持。在為期 28 天的培養(yǎng)過程中,對所有3D生物打印細(xì)胞負(fù)載 GEL/DB 構(gòu)建物的細(xì)胞相容性、生物活性和成骨分化進(jìn)行了評估。
圖1 研究示意圖

【流變特性】

本研究對 GEL 和 DB 嵌入式 GEL 生物材料油墨的流變特性進(jìn)行了評估,以模擬與打印工藝相關(guān)的油墨流動條件。每組都進(jìn)行了剪切稀化試驗(yàn),通過將剪切速率從 0 s-1 增加到 100 s-1 來測量粘度。圖 2A 顯示,所有生物材料油墨的粘度都隨著剪切速率的增加而降低,這表明所有材料都表現(xiàn)出適合擠壓式 3D 打印的剪切稀化行為。在剪切速率為 10 s-1 時(shí),GEL 的粘度被測定為 74 Pa.s,與加入 DB 粒子的組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2(B))。此外,添加不同大小和濃度的 DB 粒子也會影響粘度。經(jīng)測定,GEL/1 DB(100 μm)、GEL/5 DB(100 μm)、GEL/5 DB(45 μm)和 GEL/10%DB (45 μm)的粘度分別為 91.70、111.61、123.84 和 170.67 Pa.s,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異(圖 2(B))。與 100 μm 的 DB 顆粒相比,45 μm 的 DB 顆粒增加了油墨的粘度,其統(tǒng)計(jì)差異表明較小的顆粒尺寸增強(qiáng)了流變特性。值得注意的是,如圖 2(B)所示,摻入 10% DB 顆粒的油墨粘度更高。這可能是由于油墨內(nèi)部顆粒之間的相互作用。當(dāng)復(fù)合油墨配方中的固體顆粒之間的相互作用被剪切力破壞時(shí),就會出現(xiàn)剪切變稀的行為。油墨靜止時(shí)的粘度較高,這是由懸浮顆粒之間的相互作用重新組織決定的,從而提供了形狀穩(wěn)定性。因此,較小尺寸的 DB 顆粒濃度越高,懸浮顆粒之間的相互作用就越密集,從而導(dǎo)致粘度越高。此外,在本研究團(tuán)隊(duì)之前的研究中,本研究發(fā)現(xiàn)較高的 DB 粒子濃度(>5%)會降低可打印性,而另一方面,高濃度的 DB 粒子有助于細(xì)胞生長。本研究發(fā)現(xiàn)較小尺寸的 DB 粒子在較高濃度下會增強(qiáng)流變特性,這也是本研究的假設(shè)之一。

圖2 油墨和 3D 打印水凝膠的流變特性及打印性能評估

【3D 打印 GEL/DB 支架】
本研究對 GEL 和 GEL/DB 油墨的可打印性進(jìn)行了評估。光鏡圖像顯示了用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)后不同大小和濃度的3D打印 GEL 和 GEL/DB 水凝膠(圖 2(D))。水凝膠被制成圓柱形,具有交替的 0°/90°支桿結(jié)構(gòu),從而在支桿之間形成方形大孔。3D打印的 GEL 和 GEL/DB 水凝膠顯示出具有方形孔幾何形狀的良好打印結(jié)構(gòu)(圖 2(D))。所有墨水都很容易打印,特別是較小尺寸(45 微米)、較高濃度的 DB 粒子有利于打印,這可能是均勻分布在 GEL 基質(zhì)中的懸浮較小 DB 粒子之間相互作用的結(jié)果。盡管純 GEL 水凝膠具有透明度,但顆粒濃度越高,GEL/DB 水凝膠的濁度越高(圖 2(D))。所有組的打印適性因子(Pr)都是通過公式(1)計(jì)算得出的。Pr < 1 表示油墨凝膠不足,孔角呈圓形;Pr = 1 表示凝膠適當(dāng),孔幾何形狀呈理想的方形;而 Pr > 1 則表示油墨過度凝膠。所有組的 Pr 因子都接近 1。含有 5%DB 的 GEL 組顯示出較低 Pr 因子(Pr = 0.9 ± 0.04)的圓形孔幾何形狀,與純 GEL 水凝膠相比,本研究發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)差異(圖 2(E))。根據(jù)之前的報(bào)道,當(dāng) Pr 因子在 0.9 和 1.1 之間時(shí),3D打印水凝膠會顯示出適當(dāng)?shù)墓尚螒B(tài)。因此,5% 的 DB 粒子(100 微米大小)會降低3D打印性能,而 5%的 DB 粒子(45 微米大小)則顯示出最佳打印性能。此外,5% 的 DB 粒子(粒徑為 45 微米)的 Pr 系數(shù)為 0.9,具有足夠的打印能力和形狀保真度。與純 GEL 組相比,將顆粒尺寸減小到 45 微米可提高 5% DB 組的可打印性,但在統(tǒng)計(jì)上沒有差異。

【生物打印的 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞負(fù)載 GEL/DB 構(gòu)建物】
本研究成功制作了負(fù)載 1% GEL/DB 構(gòu)建物的 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞,并在細(xì)胞培養(yǎng)期間用光學(xué)顯微鏡觀察了細(xì)胞在構(gòu)建物內(nèi)的分布和定位情況。圖 3 顯示了 GEL 和 GEL/DB 結(jié)構(gòu)以及 TCP(組織培養(yǎng)聚苯乙烯)對照組內(nèi)部的細(xì)胞光鏡圖像。在生物打印之前,制備了含有 MC3T3-E1 的2D鑄造 GEL 和 GEL/DB 水凝膠,以觀察水凝膠中的細(xì)胞。由于 GEL 水凝膠是完全透明的,因此不易分辨水凝膠的邊緣。如圖 3(A)所示,GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的細(xì)胞都是可見的,7 d 后可觀察到附著和伸長的細(xì)胞(圖 3(A))。此外,還觀察到細(xì)胞附著在 GEL/DB 水凝膠中的 DB 顆粒上(圖 3(A))。在3D生物打印樣品中,MC3T3-E1 細(xì)胞分布在 GEL 和 GEL/1% DB 構(gòu)建物中,并且在細(xì)胞培養(yǎng)期間不斷增殖(圖 3(B))。此外,如圖 3(C)中的放大圖片所示,14 天后,細(xì)胞遷移到結(jié)構(gòu)表面,并完全覆蓋了3D生物打印結(jié)構(gòu)。GEL水凝膠在 14 天后會降解,并開始在細(xì)胞培養(yǎng)基中失重,這在之前的報(bào)道中已有提及。由于 GEL 開始降解,細(xì)胞可以在 3D 打印的結(jié)構(gòu)中找到空間并在結(jié)構(gòu)中遷移。在培養(yǎng)期間,隨著結(jié)構(gòu)的降解和細(xì)胞的增殖,細(xì)胞遷移到結(jié)構(gòu)外,并在細(xì)胞培養(yǎng)板上觀察到細(xì)胞,如放大圖像所示(圖 3(C))。此外,GEL 的特定 RGD 序列允許細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)期間粘附和增殖,這證明了 GEL 和 GEL/DB 生物墨水配方的細(xì)胞相容性。
圖3 充滿細(xì)胞的2D鑄模和3D生物打印結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡圖像

在3D生物制造結(jié)構(gòu)中,保持細(xì)胞活力和3D打印結(jié)構(gòu)的形狀保真度或穩(wěn)定性是一個(gè)重要的關(guān)鍵因素。因此,在培養(yǎng)期間對3D生物打印結(jié)構(gòu)中的 MC3T3-E1 細(xì)胞進(jìn)行活/死染色后,對其存活率進(jìn)行了觀察。熒光顯微鏡圖像顯示了活細(xì)胞(綠色)、死細(xì)胞(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)(圖 4)。DB 顆粒也因其自發(fā)熒光而顯示為藍(lán)色/綠色。圖像顯示,MC3T3-E1 細(xì)胞在第 7 天時(shí)附著在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)并保持活力(圖 4(A))。14 天后,細(xì)胞在結(jié)構(gòu)中附著和擴(kuò)散得更多,只觀察到少量死細(xì)胞(圖 4(A))。培養(yǎng) 14 d 后,DAPI 染色顯示細(xì)胞核密集。此外,2D細(xì)胞負(fù)載 GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的 MC3T3-E1 細(xì)胞在第 14 天仍保持活力(圖 4(B))。活/死染色結(jié)果證實(shí),GEL 和 GEL/DB 墨水配方具有細(xì)胞相容性,不會損害 MC3T3-E1 細(xì)胞的活力。

圖4 MC3T3-E1 細(xì)胞的活/死染色結(jié)果

在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi),用 LDH 細(xì)胞毒性檢測法評估了油墨可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性效應(yīng)。在2D細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞釋放的細(xì)胞外 LDH 水平相似,在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異(圖 5(A))。然而,3D生物打印組在第 1 天的 LDH 水平明顯更高(圖 5(A))。早期 LDH 水平較高的原因可能是3D生物打印過程中剪切力導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在隨后的培養(yǎng)天數(shù)中,細(xì)胞外 LDH 水平持續(xù)下降,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這表明剩余細(xì)胞在后期培養(yǎng)中存活并增殖。MC3T3-E1 細(xì)胞的存活率是根據(jù) WST-8 法測定的細(xì)胞代謝活性進(jìn)行量化的,數(shù)據(jù)顯示,在整個(gè)培養(yǎng)過程中,各組細(xì)胞的存活率都在逐漸增加(圖5(B))。此外,3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 結(jié)構(gòu)的細(xì)胞存活率較高,與2D澆鑄組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外,與其他組相比,3D生物打印 GEL/DB 結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞存活率最高(圖 5(B))。

【細(xì)胞增殖和形態(tài)】
根據(jù) PicoGreen 檢測法對dsDNA 的定量分析,本研究評估了生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞增殖情況。與根據(jù)代謝活性得出的存活率結(jié)果(圖 5(B))一致,生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)量在細(xì)胞培養(yǎng)期間逐漸增加(圖 5(C))。第一天,生物打印結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞數(shù)量低于2D澆注水凝膠中的細(xì)胞數(shù)量,這可能是圖 5(A)所示第一天釋放的 LDH 較高的結(jié)果。第一天之后,2D澆注水凝膠組的細(xì)胞數(shù)量在第 7 天有所增加,然后在整個(gè)培養(yǎng)期間保持穩(wěn)定。另一方面,3D生物打印結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞在 28 天內(nèi)繼續(xù)增殖,與2D水凝膠相比,在第 7 天、14 天和 28 天發(fā)現(xiàn)了顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外,在第 21 天,生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物中的細(xì)胞數(shù)量最多,與3D打印 GEL 組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 5(C))。根據(jù)細(xì)胞毒性、存活率和增殖調(diào)查,GEL 和 DB 加入 GEL 的生物墨水為生物打印后的細(xì)胞生長提供了3D微環(huán)境,作為一種基于天然的最小化生物墨水配方,顯示出良好的效果。

本研究利用熒光顯微鏡評估了3D生物打印結(jié)構(gòu)和2D澆注水凝膠內(nèi)的細(xì)胞粘附性和細(xì)胞形態(tài)。DAPI 和 F-Actin 染色分別顯示 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞核(藍(lán)色)和細(xì)胞骨架(綠色)。顯微鏡圖像顯示了2D鑄造和3D生物打印結(jié)構(gòu)的細(xì)胞粘附情況,以及培養(yǎng) 28 天后細(xì)胞與材料的相互作用(圖 5(D))。2D澆鑄組在第 28 天顯示了細(xì)胞與材料的相互作用,細(xì)胞覆蓋了 DB 嵌入 GEL 水凝膠內(nèi)的 DB 顆粒表面(圖 5(D))。在3D生物打印 GEL/DB 組中,細(xì)胞覆蓋了結(jié)構(gòu),顯示出與 DB 粒子非常積極的相互作用,此外,細(xì)胞在第 28 天覆蓋了孔區(qū)域,這可以從放大圖像中看到(圖 5(D))。

圖5 細(xì)胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)生長

【評估不同大小和濃度的 DB 粒子對負(fù)載 hTERT-間充質(zhì)干細(xì)胞的3D生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物的細(xì)胞行為的影響】

本研究對3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞存活率通過活/死染色進(jìn)行了評估。熒光顯微鏡圖像顯示,在 28 天的培養(yǎng)期間,細(xì)胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)存活和生長(圖 6)。此外,由于膠原纖維的自發(fā)熒光,DB 顆粒顯示出藍(lán)色。第一天,在所有組中都觀察到大量存活細(xì)胞(綠色),并檢測到細(xì)胞集群,特別是在 DB 結(jié)合的結(jié)構(gòu)中。由于顆粒密度高且具有自發(fā)熒光,hTERT-間充質(zhì)干細(xì)胞在第一天并不清晰可見。然而,大面積的綠色染色,尤其是在 10%的 DB 組中,表明結(jié)構(gòu)內(nèi)形成了細(xì)胞簇(圖 6)。7 天后,細(xì)胞開始在生物打印結(jié)構(gòu)中伸長和擴(kuò)散,之后細(xì)胞在 28 天的培養(yǎng)期內(nèi)保持活力并不斷增殖。hTERT 間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)散良好,培養(yǎng) 28 d 后觀察到細(xì)胞完全覆蓋。此外,活細(xì)胞的密度在所有培養(yǎng)日都很高。即使在第 28 天也很難發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞(紅色),這表明油墨配方具有細(xì)胞相容性,較高的 DB 粒子濃度有助于細(xì)胞生長。

圖6 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 復(fù)合結(jié)構(gòu)中 hTERT-MSC 細(xì)胞第 14 天的活/死染色結(jié)果

生物打印后,使用 LDH 細(xì)胞毒性檢測法對墨水材料的潛在細(xì)胞毒性進(jìn)行量化。將含有細(xì)胞的結(jié)構(gòu)培養(yǎng) 28 天,在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞外 LDH 釋放量進(jìn)行量化。結(jié)果顯示,在整個(gè)培養(yǎng)過程中,各組的 LDH 水平都保持穩(wěn)定,沒有增加。各時(shí)間點(diǎn)和各組之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這表明含有 GEL 成分的 DB 對 hTERT-間充質(zhì)干細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用(圖 7(A))。正如在 GEL 構(gòu)建物中加入兔 DB 粒子(圖 4 和圖 5)所顯示的那樣,牛 DB 粒子對 hTERT-MSC 也沒有細(xì)胞毒性作用。

圖7 生物打印 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi) hTERT-MSC 細(xì)胞的生物活性

本研究利用共聚焦顯微鏡詳細(xì)評估了3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞附著情況。細(xì)胞核(藍(lán)色)和細(xì)胞骨架(綠色)分別采用 DAPI 和 F-Actin 染色(圖 8)。此外,由于 DB 顆粒中纖維膠原的自發(fā)熒光,結(jié)構(gòu)內(nèi)部的 DB 顆粒也清晰可見(呈紅色/粉紅色)。圖像顯示,細(xì)胞在第 28 天時(shí)在3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)部生長和增殖(圖 8)。細(xì)胞在 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)附著并伸長,所有組中都能看到細(xì)胞覆蓋的趨勢。值得注意的是,在含有 10% DB 的 GEL 構(gòu)建物中觀察到了更大的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)以及與 DB 顆粒的良好互動。這種細(xì)胞粘附性表明,細(xì)胞與 GEL/DB 組中均勻分布的 DB 顆粒進(jìn)行了理想的相互作用。

圖8 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 構(gòu)建物內(nèi)生長的 hTERT 間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)第 28 天時(shí)的共聚焦顯微鏡圖像

2. 總結(jié)與展望
本研究展示了一種由 GEL、DB 顆粒和 MC3T3-E1 前成骨細(xì)胞或 hTERT-MSCs組成的最小化生物墨水配方。本研究的主要方法是利用骨組織的天然 ECM 成分,并確定顆粒的理想濃度,以獲得更好的細(xì)胞反應(yīng)。本研究中使用的 DB 顆粒不僅含有膠原纖維,還含有羥基磷灰石,而現(xiàn)有研究同時(shí)使用了脫細(xì)胞和脫礦物質(zhì)過程,這導(dǎo)致骨的生物礦化特性被削弱。此外,本研究還提出了基于 GEL 的 mTG 交聯(lián)(一種已獲 FDA 批準(zhǔn)的材料)簡約生物墨水配方,與使用多種改性劑或化學(xué)成分的復(fù)雜水凝膠系統(tǒng)相比,這種配方可以直接制備,而這些改性劑或化學(xué)成分可能會產(chǎn)生細(xì)胞毒性,也無法用于臨床。

文章來源:https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98

(責(zé)任編輯:admin)

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