載有間充質干細胞衍生外泌體的3D打印支架以改善血管生成和成骨
時間：2024-06-19 08:51 來源：EFL生物3D打印與生物制造 作者：admin 閱讀：次
顱面骨再生是血管生成和成骨的耦合過程，與感染相關，在創傷或腫瘤切除后的骨缺損中仍然是一個挑戰。具有多功能治療特性的3D組織工程支架可以為受感染骨缺損的血管生成和成骨提供許多優勢。近日，來自大連理工大學的宋克東研究員、大連理工大學附屬腫瘤醫院的姜大慶醫師聯合中科院過程所聶毅研究員團隊利用擠壓3D打印設計了一種富含微通道網絡的混合支架，該支架由脫細胞細胞外基質(dECM)、明膠(Gel)、季銨化殼聚糖(QCS)和納米羥基磷灰石(nHAp)(dGQH)組成（圖1）。
相關研究成果以“3D bioprinting of dECM/Gel/QCS/nHAp hybrid scaffolds laden with mesenchymal stem cell-derived exosomes to improve angiogenesis and osteogenesis”為題于2023年2月9日發表在《Biofabrication》上。
1. 生物墨水的合成和流變學特性
作者首先測試了dGQ 和 dGQH 生物墨水的流變行為以評估它們的可印刷性。如圖2A-B所示，dGQ 和 dGQH 生物墨水的復合粘度和儲能模量隨溫度降低而增加，結果表明所制備的生物墨水具有良好的溫度敏感性。此外，由于nHAp含量的增加，凝膠的相對濃度降低，導致dGQH生物墨水的預凝膠溫度與dGQ生物墨水相比有所降低（圖2E）。生物墨水的粘度隨著剪切速率的增加而降低，這是非牛頓流體和剪切稀化的典型行為，特別適用于基于擠出的 3D 打印系統（圖2F）。從流變學結果可以看出，生物墨水具有良好的印刷適性和穩定的物理性能，圖2I顯示了正在打印的支架以及凍干前后的生物打印支架。
2. 支架的理化性質
之后，作者首先對這些支架進行了拉伸和壓縮試驗，以分析它們的機械性能。由于支架的拉伸和壓縮應力-應變分別如圖3C-F所示，支架的拉伸模量和壓縮模量高于dGQ支架。測試結果表明，nHAp可以在一定范圍內提高支架的機械強度，但如果nHAp含量過高，支架會變脆。作者還測試了支架的空隙率（圖3G）、蛋白吸附性（圖3H）以及支架的溫度穩定性（圖3I）。
3. 支架的親水性、降解性和血液相容性
接著，作者探究了支架的親水性、降解性和血液相容性。圖4A-B記錄了這些支架表面水接觸角在20 s內的變化過程。可以直觀地發現支架的接觸角隨著nHAp的增加而增加，表明nHAp可能會降低支架的親水性。當支架達到溶脹平衡時，dGQH支架的吸水率低于dGQ支架，隨著nHAp含量的增加，吸水率略有下降（圖4C-E）。
從圖4F的結果可以看出，dGQ支架在2周內降解了約80%，到3周時幾乎完全降解，不利于新骨組織的形成。而nHAp的加入有效地降低了支架的降解速率，這可能是由于 nHAp 增加了酶反應的空間位阻效應。
此外，溶血是評價生物材料生物相容性的重要指標。在這里，支架的體外血液相容性通過溶血測定進行評估（圖4G）。支架的溶血率隨著nHAp的添加而降低。dGQH支架的所有溶血率均小于1%，遠低于dGQ支架（圖4H)。
4. 支架的抗菌性能
用于顱骨傷口修復的支架的抗菌活性對于防止感染和加速缺損骨的再生是必要的，因此作者對支架的抗菌能力進行了評估（圖5）。支架培養24小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 CFU，表明 dGQ 和 dGQH 支架具有顯著的抗菌活性（圖6A-B）。隨著nHAp含量的增加，其抑菌活性減弱，這可能是QCS相對濃度降低所致。在dGQH支架中，dGQH20具有優異的抗菌性能，在骨組織工程中具有重要的應用前景。
5. 支架的生物相容性和成骨特性
之后作者在含有不同量的 nHAP（0、20%、30% 和 40%）的支架上培養的hBMSCs 中評估細胞粘附、增殖和成骨蛋白表達（圖6）。結果得出 nHAP 摻入模式和嵌入 nHAP 的濃度改變細胞活力和增殖的結論。與不存在 nHAP 的情況相比，nHAP 導致細胞增殖顯著減少；隨著支架中 nHAP 數量的增加，細胞增殖減少（圖6A-B）。
支架的成骨特性通過特定成骨分化標記蛋白（包括 ALP、Runx2 和 Ocn）的表達進行評估。dGQH20支架顯示出顯著上調的 ALP、Runx2 和 Ocn 表達（圖6C）。這些發現表明dGQH20在所有成骨階段都有效地促進了hBMSC成骨分化，與蛋白質印跡數據一致。為了確定 hBMSCs 在這些支架上的礦物質沉積，在第 14 天進行了 ARS 染色和 V on Kossa 染色（圖6D）。
6. hADSCs-Exos 的體外生物學特性及其支架特性
為了評估dGQH20、Exo和dGQH20@Exo支架的生物相容性，CCK-8測定表明Exo 組中的 hBMSC 增殖明顯高于對照組（圖7A）。與所有其他組相比，在具有獨特納米結構的3D生物打印支架中培養并進一步增強了dGQH20@Exo組中 hBMSC 的增殖。在不同組中探討了對血管生成和成骨蛋白標記物表達的影響。在指定時間點收集人 BMSC 并進行蛋白質印跡（圖7B）。與沒有Exos的各自支架組相比，固定在dGQH20 支架上的Exos中 Runx2、Ocn和VEGF的蛋白質表達顯著更高。
為了進一步評估促血管生成和促成骨作用，ARS、ALP和V on Kossa染色用于觀察hBMSCs的成骨分化，并測量了 HUVEC 在傷口愈合、遷移和管形成中的功能（圖7C-D）。與 ALP 染色的趨勢相似，ARS 和 V on Kossa 染色表明，與其他三組相比，dGQH20@Exo 組顯著增加了hBMSC的礦化結節形成；dGQH20@Exo組HUVECs的傷口愈合和遷移能力明顯強于其他組。
7. 體內骨再生和血管化評估
在證明了dGQH20@Exo支架的體外生物學效應后，之后確定了dGQH20@Exo支架對體內成骨和血管生成的功效。通過植入大鼠顱骨缺損模型 10 周，研究了支架的體內骨再生能力，并在小鼠皮下植入模型中評估了支架的體內血管形成。
為了觀察缺損區域的骨再生，將樣品切成切片并用 H&E、Masson 的 T richome (MT)、ALP、Runx2、Ocn、CD31 和 VEGF 抗體染色（圖8A–C）。結果表明支架組ALP、Runx2和Ocn、CD31和VEGF表達水平較高；特別是對于 dGQH20@Exo組，成骨和血管生成蛋白表達水平被確定為最高。
綜上，本文制備了基于dECM的生物墨水，并通過擠出3D生物打印技術制造了dECM/Gel/QCS/nHAp 3D支架(dGQH)。對支架的形態、機械性能、孔隙率、親水性、生物降解性、抗菌能力、血液相容性和生物相容性進行了表征和評估。此外，dGQH20混合支架具有良好的抗菌活性以及出色的血液相容性和生物相容性。受天然骨微結構特征和血管化骨再生需求的啟發，基于靜電相互作用將血管生成因子和成骨因子（Exos）共同負載到dGQH20支架中。結果表明，添加的 Exos 促進了細胞在支架上的附著和增殖，并且在體外和體內 dGQH@Exo 支架中的成骨和血管再生也顯著增加。
文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb6b8
相關研究成果以“3D bioprinting of dECM/Gel/QCS/nHAp hybrid scaffolds laden with mesenchymal stem cell-derived exosomes to improve angiogenesis and osteogenesis”為題于2023年2月9日發表在《Biofabrication》上。
圖1 dECM/Gel/QCS/nHAp@Exo混合支架的制造和機制示意圖
1. 生物墨水的合成和流變學特性
作者首先測試了dGQ 和 dGQH 生物墨水的流變行為以評估它們的可印刷性。如圖2A-B所示，dGQ 和 dGQH 生物墨水的復合粘度和儲能模量隨溫度降低而增加，結果表明所制備的生物墨水具有良好的溫度敏感性。此外，由于nHAp含量的增加，凝膠的相對濃度降低，導致dGQH生物墨水的預凝膠溫度與dGQ生物墨水相比有所降低（圖2E）。生物墨水的粘度隨著剪切速率的增加而降低，這是非牛頓流體和剪切稀化的典型行為，特別適用于基于擠出的 3D 打印系統（圖2F）。從流變學結果可以看出，生物墨水具有良好的印刷適性和穩定的物理性能，圖2I顯示了正在打印的支架以及凍干前后的生物打印支架。
圖2 dGQ 和 dGQH 生物墨水的流變學特性
2. 支架的理化性質
之后，作者首先對這些支架進行了拉伸和壓縮試驗，以分析它們的機械性能。由于支架的拉伸和壓縮應力-應變分別如圖3C-F所示，支架的拉伸模量和壓縮模量高于dGQ支架。測試結果表明，nHAp可以在一定范圍內提高支架的機械強度，但如果nHAp含量過高，支架會變脆。作者還測試了支架的空隙率（圖3G）、蛋白吸附性（圖3H）以及支架的溫度穩定性（圖3I）。
圖3 支架的理化性質
3. 支架的親水性、降解性和血液相容性
接著，作者探究了支架的親水性、降解性和血液相容性。圖4A-B記錄了這些支架表面水接觸角在20 s內的變化過程。可以直觀地發現支架的接觸角隨著nHAp的增加而增加，表明nHAp可能會降低支架的親水性。當支架達到溶脹平衡時，dGQH支架的吸水率低于dGQ支架，隨著nHAp含量的增加，吸水率略有下降（圖4C-E）。
從圖4F的結果可以看出，dGQ支架在2周內降解了約80%，到3周時幾乎完全降解，不利于新骨組織的形成。而nHAp的加入有效地降低了支架的降解速率，這可能是由于 nHAp 增加了酶反應的空間位阻效應。
此外，溶血是評價生物材料生物相容性的重要指標。在這里，支架的體外血液相容性通過溶血測定進行評估（圖4G）。支架的溶血率隨著nHAp的添加而降低。dGQH支架的所有溶血率均小于1%，遠低于dGQ支架（圖4H)。
圖4 支架的親水性和血液相容性
4. 支架的抗菌性能
用于顱骨傷口修復的支架的抗菌活性對于防止感染和加速缺損骨的再生是必要的，因此作者對支架的抗菌能力進行了評估（圖5）。支架培養24小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 CFU，表明 dGQ 和 dGQH 支架具有顯著的抗菌活性（圖6A-B）。隨著nHAp含量的增加，其抑菌活性減弱，這可能是QCS相對濃度降低所致。在dGQH支架中，dGQH20具有優異的抗菌性能，在骨組織工程中具有重要的應用前景。
圖5 支架的抗菌性能
5. 支架的生物相容性和成骨特性
之后作者在含有不同量的 nHAP（0、20%、30% 和 40%）的支架上培養的hBMSCs 中評估細胞粘附、增殖和成骨蛋白表達（圖6）。結果得出 nHAP 摻入模式和嵌入 nHAP 的濃度改變細胞活力和增殖的結論。與不存在 nHAP 的情況相比，nHAP 導致細胞增殖顯著減少；隨著支架中 nHAP 數量的增加，細胞增殖減少（圖6A-B）。
支架的成骨特性通過特定成骨分化標記蛋白（包括 ALP、Runx2 和 Ocn）的表達進行評估。dGQH20支架顯示出顯著上調的 ALP、Runx2 和 Ocn 表達（圖6C）。這些發現表明dGQH20在所有成骨階段都有效地促進了hBMSC成骨分化，與蛋白質印跡數據一致。為了確定 hBMSCs 在這些支架上的礦物質沉積，在第 14 天進行了 ARS 染色和 V on Kossa 染色（圖6D）。
圖6 支架的生物相容性和成骨特性
6. hADSCs-Exos 的體外生物學特性及其支架特性
為了評估dGQH20、Exo和dGQH20@Exo支架的生物相容性，CCK-8測定表明Exo 組中的 hBMSC 增殖明顯高于對照組（圖7A）。與所有其他組相比，在具有獨特納米結構的3D生物打印支架中培養并進一步增強了dGQH20@Exo組中 hBMSC 的增殖。在不同組中探討了對血管生成和成骨蛋白標記物表達的影響。在指定時間點收集人 BMSC 并進行蛋白質印跡（圖7B）。與沒有Exos的各自支架組相比，固定在dGQH20 支架上的Exos中 Runx2、Ocn和VEGF的蛋白質表達顯著更高。
為了進一步評估促血管生成和促成骨作用，ARS、ALP和V on Kossa染色用于觀察hBMSCs的成骨分化，并測量了 HUVEC 在傷口愈合、遷移和管形成中的功能（圖7C-D）。與 ALP 染色的趨勢相似，ARS 和 V on Kossa 染色表明，與其他三組相比，dGQH20@Exo 組顯著增加了hBMSC的礦化結節形成；dGQH20@Exo組HUVECs的傷口愈合和遷移能力明顯強于其他組。
圖7 hADSCs-Exos 的體外生物學特性
7. 體內骨再生和血管化評估
在證明了dGQH20@Exo支架的體外生物學效應后，之后確定了dGQH20@Exo支架對體內成骨和血管生成的功效。通過植入大鼠顱骨缺損模型 10 周，研究了支架的體內骨再生能力，并在小鼠皮下植入模型中評估了支架的體內血管形成。
為了觀察缺損區域的骨再生，將樣品切成切片并用 H&E、Masson 的 T richome (MT)、ALP、Runx2、Ocn、CD31 和 VEGF 抗體染色（圖8A–C）。結果表明支架組ALP、Runx2和Ocn、CD31和VEGF表達水平較高；特別是對于 dGQH20@Exo組，成骨和血管生成蛋白表達水平被確定為最高。
圖8 體內骨再生和血管化評估
綜上，本文制備了基于dECM的生物墨水，并通過擠出3D生物打印技術制造了dECM/Gel/QCS/nHAp 3D支架(dGQH)。對支架的形態、機械性能、孔隙率、親水性、生物降解性、抗菌能力、血液相容性和生物相容性進行了表征和評估。此外，dGQH20混合支架具有良好的抗菌活性以及出色的血液相容性和生物相容性。受天然骨微結構特征和血管化骨再生需求的啟發，基于靜電相互作用將血管生成因子和成骨因子（Exos）共同負載到dGQH20支架中。結果表明，添加的 Exos 促進了細胞在支架上的附著和增殖，并且在體外和體內 dGQH@Exo 支架中的成骨和血管再生也顯著增加。
文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb6b8
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