南開大學《ACS Nano》：蘆丁納米顆粒光抑制劑助力高效光基生物3D打印
時間：2024-08-20 16:10 來源：EFL生物3D打印與生物制造 作者：admin 閱讀：次
數字光處理（DLP）3D打印技術以其高分辨率和高打印速度而備受關注，其通過精密的逐層投影進行打印，能夠實現生物材料在空間上的的精準排列，現已成為組織工程和再生醫學中不可或缺的重要工具。然而，對于基于光基聚合的打印方式，高保真度取決于對光-材料相互作用的精確控制。在DLP打印過程中，固有的光線散射以及不精確的固化深度控制使得自由基反應在設計區域外發生，這些多余的聚合反應會造成打印模型的扭曲和失真，極大地影響了制造結構的保真度。為了減輕非預期聚合帶來的不良影響，在之前的研究中往往通過添加光吸收劑來在空間上限制光線的分布，將光線最大程度地集中在單層的設計區域中，以提高打印精度。然而，這種基于光吸收的策略極大地耗散了激發光中的能量，導致打印速度下降；同時也難以在充滿細胞的環境下發揮功能。追根溯源，一種更為全面、高效的策略不僅需要通過光吸收限制光的分布，更應該通過與自由基反應，將自由基反應嚴格地限制在設計區域內，進一步提升加工精度。同時，還需要考慮打印速度的提升以及適宜的細胞相容性，以期實現一種高精度、快速度和細胞親和的高效生物制造模式（圖1）。
鑒于此，南開大學孔德領教授、博士后董顯豪聯合天津市第一中心醫院范猛主任在《ACS NANO》上發表題為“Efficient Light-Based Bioprinting via Rutin Nanoparticle Photoinhibitor for Advanced Biomedical Applications”的研究論文。利用天然黃酮類化合物中最廉價易得的蘆丁，通過在溫和、綠色的水溶液環境中簡單的一步自組裝方法，開發了一種新型水溶性光抑制添加劑——蘆丁納米顆粒（Rnps）。Rnps能夠同時進行光吸收過程和自由基反應，因此能夠抑制散射效應，提升打印精度。
作者通過將蘆丁粉末溶解在NaOH溶液中，此時蘆丁以蘆丁鈉鹽的形式存在（NaR），隨后通過調節pH使蘆丁和NaR發生分子間自組裝形成Rnps。光吸收劑檸檬黃（Tar）由于其良好的生物相容性，被廣泛用于各種生物制造中。因此，作者選擇Tar作為對照，比較了Rnps和Tar對405nm打印波長光線的吸收能力，并檢測了不同濃度Rnps的自由基清除能力。結果表明，Rnps對405nm光線的吸收能力與Tar不相上下，且在水中表現出良好的ABTS自由基清除能力，有利于其在光—自由基打印中發揮有效功能（圖2）。
為了驗證Rnps在生物墨水中發揮的具體作用，作者以5% GelMA（EFL-GM）為例，測試了具有不同濃度Rnps的生物墨水的具體性質，包括流變特性、力學性能、穩定性、打印速率等。使用EFL品牌的DLP生物3D打印機（EFL-BP8601 Pro）對打印，以便開展后續測試。實驗結果證明，Rnps的加入并不會影響打印支架的機械性能。相較于只進行光吸收的Tar，Rnps的加入能夠改善打印的層間均質性，同時也抑制了打印過程中，由多余自由基反應導致的墨水粘度提升。此外，加入0.1%Rnps的生物墨水展現出更快的制備速度，這有利于其在生物打印中的應用（圖3）。
為了證明Rnps在提高打印分辨率和圖案保真度方面的能力，作者通過打印輻條狀圖案來評估打印的橫向分辨率。隨著Rnps濃度的增加，觀察到保真度提高，且0.1% Rnps組獲得的最佳可打印分辨率顯著超過0.1% Tar組。打印精度的提高歸因于Rnps同時進行的光吸收和自由基清除過程，說明該策略有效提高了打印精度和圖案細節的保真度。接下來，作者研究了Rnps在多層豎直孔道結構制造中的作用。在打印直徑為2mm和1mm通道時，0.1% Rnps組與0.1% Tar組相比，過固化和通道堵塞顯著減少，這與Rnps在打印過程中抑制墨水粘度上升有關。結果分析表明，Rnps在打印更精細的孔道結構時比傳統光吸收劑更具優勢（圖4）。
在生物打印中，生物墨水的細胞相容性對于維持細胞的存活和增殖至關重要。作者使用人誘導多能干細胞衍生的內皮細胞（hiPSC-ECs）進行細胞種植和載細胞打印。基于打印精度、速度和細胞兼容性進行篩選，最后選擇含有 0.1% Rnps 的生物墨水用于后續實驗。蘆丁已被證實具備多種有益的生物活性，包括抗炎特性、線粒體代謝調控，以及顯著的抗凋亡能力。作者為了驗證Rnps是否保留了抗氧化調節能力，在細胞經Tar或Rnps處理后，使用H2O2對其進行氧化刺激，隨后分別測量胞內ROS、超氧化物的濃度以及線粒體膜電位水平。作者還通過qPCR驗證了抗氧化/抗凋亡相關基因表達的變化情況。結果證實了Rnps在胞內不僅參與自由基清除，同時也介導細胞修復和凋亡抵抗力增強，賦予細胞抵抗氧化應激和避免凋亡的卓越能力（圖5）。
Rnps在復雜結構制造和多材料打印中也展現了良好的性能。作者采用含有Rnps的生物墨水，成功地制作具有TPMS結構的復雜支架，所得結構特征薄壁的厚度在50到150μm之間，在細節上顯示出高分辨率。同時，由于Rnps對于多種生物墨水的良好兼容性，使其能夠在多材料制備中發揮作用，以實現多種材料在空間上的精確分布，比如金字塔模型所示的連續梯度材料的制備，以及如魔方模型所示的多材料一體化打印。EFL研發的多材料DLP生物打印機（EFL-BP8601 Mix）為具有結構復雜性的多材料模型制備提供了平臺。在氣管狀模型、肝小葉、手掌模型等器官結構的仿生構建中，作者利用基于Rnps的多材料打印，模擬了這些器官在結構上的復雜性。為了體現該打印方式在藥物精確負載中的應用，作者設計并構建了具有“NKU”內嵌復雜結構的藥片以及一個多藥物集成負載的藥片模型，以展現其載藥的便利性以及高通量。此外，作者還通過打印不同種類的載細胞空心分叉管結構，展示了基于Rnps的載細胞打印在可灌注血管樣組織制備中的應用。這些結構的成功制備，進一步說明了基于Rnps的打印方法在多種生物醫學場景下的應用潛力（圖6）。
全文總結
本研究中開發了一種簡單而普適的蘆丁基光抑制劑——Rnps，其通過同時進行光吸收過程和自由基反應，能夠有效地減弱DLP 3D打印中光散射的影響，提升打印保真度。與Tar相比，含有Rnps的生物墨水打印速度提升至1.9倍，層間過曝減少58%，分辨率提高38.3%，高精度打印區間擴大至3倍。使用這種光抑制劑制備的支架具有出色的細胞相容性以及出色的抗氧化活性。Rnps能夠適用于各種生物墨水，是創建多材料和多功能生物醫學結構的理想工具。將Rnps集成到其他生物制造平臺中可能會為組織和器官的復雜體外重建提供更多技術支持，從而加速其從理論模型到臨床轉化的發展進程。
南開大學生命科學學院孔德領課題組碩士生李飛逸，本科生李馨月，博士生代殊昕為本文共同第一作者。該研究工作得到國家自然科學基金創新研究群體項目和青年項目，以及博士后基金面上項目與物質綠色創造與制造海河實驗室等項目的支持。在這項研究中，應用了EFL品牌的投影式光固化生物3D打印機（EFL-BP8601 Pro、EFL-BP8601 Mix），和EFL品牌的多種光固化生物材料（EFL-GM、EFL-F127DA、EFL-HAMA等）進行實驗，感謝EFL對研究工作的鼎力支持。
文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05380
鑒于此，南開大學孔德領教授、博士后董顯豪聯合天津市第一中心醫院范猛主任在《ACS NANO》上發表題為“Efficient Light-Based Bioprinting via Rutin Nanoparticle Photoinhibitor for Advanced Biomedical Applications”的研究論文。利用天然黃酮類化合物中最廉價易得的蘆丁，通過在溫和、綠色的水溶液環境中簡單的一步自組裝方法，開發了一種新型水溶性光抑制添加劑——蘆丁納米顆粒（Rnps）。Rnps能夠同時進行光吸收過程和自由基反應，因此能夠抑制散射效應，提升打印精度。
圖1 Rnps的制備過程及其在光基生物打印中作為光抑制劑的特性示意圖
作者通過將蘆丁粉末溶解在NaOH溶液中，此時蘆丁以蘆丁鈉鹽的形式存在（NaR），隨后通過調節pH使蘆丁和NaR發生分子間自組裝形成Rnps。光吸收劑檸檬黃（Tar）由于其良好的生物相容性，被廣泛用于各種生物制造中。因此，作者選擇Tar作為對照，比較了Rnps和Tar對405nm打印波長光線的吸收能力，并檢測了不同濃度Rnps的自由基清除能力。結果表明，Rnps對405nm光線的吸收能力與Tar不相上下，且在水中表現出良好的ABTS自由基清除能力，有利于其在光—自由基打印中發揮有效功能（圖2）。
圖2 Rnps的合成與表征
為了驗證Rnps在生物墨水中發揮的具體作用，作者以5% GelMA（EFL-GM）為例，測試了具有不同濃度Rnps的生物墨水的具體性質，包括流變特性、力學性能、穩定性、打印速率等。使用EFL品牌的DLP生物3D打印機（EFL-BP8601 Pro）對打印，以便開展后續測試。實驗結果證明，Rnps的加入并不會影響打印支架的機械性能。相較于只進行光吸收的Tar，Rnps的加入能夠改善打印的層間均質性，同時也抑制了打印過程中，由多余自由基反應導致的墨水粘度提升。此外，加入0.1%Rnps的生物墨水展現出更快的制備速度，這有利于其在生物打印中的應用（圖3）。
圖3 光敏生物墨水配方和打印性能的優化
為了證明Rnps在提高打印分辨率和圖案保真度方面的能力，作者通過打印輻條狀圖案來評估打印的橫向分辨率。隨著Rnps濃度的增加，觀察到保真度提高，且0.1% Rnps組獲得的最佳可打印分辨率顯著超過0.1% Tar組。打印精度的提高歸因于Rnps同時進行的光吸收和自由基清除過程，說明該策略有效提高了打印精度和圖案細節的保真度。接下來，作者研究了Rnps在多層豎直孔道結構制造中的作用。在打印直徑為2mm和1mm通道時，0.1% Rnps組與0.1% Tar組相比，過固化和通道堵塞顯著減少，這與Rnps在打印過程中抑制墨水粘度上升有關。結果分析表明，Rnps在打印更精細的孔道結構時比傳統光吸收劑更具優勢（圖4）。
圖4 通過富含Rnps的生物墨水提高打印分辨率和結構保真度
在生物打印中，生物墨水的細胞相容性對于維持細胞的存活和增殖至關重要。作者使用人誘導多能干細胞衍生的內皮細胞（hiPSC-ECs）進行細胞種植和載細胞打印。基于打印精度、速度和細胞兼容性進行篩選，最后選擇含有 0.1% Rnps 的生物墨水用于后續實驗。蘆丁已被證實具備多種有益的生物活性，包括抗炎特性、線粒體代謝調控，以及顯著的抗凋亡能力。作者為了驗證Rnps是否保留了抗氧化調節能力，在細胞經Tar或Rnps處理后，使用H2O2對其進行氧化刺激，隨后分別測量胞內ROS、超氧化物的濃度以及線粒體膜電位水平。作者還通過qPCR驗證了抗氧化/抗凋亡相關基因表達的變化情況。結果證實了Rnps在胞內不僅參與自由基清除，同時也介導細胞修復和凋亡抵抗力增強，賦予細胞抵抗氧化應激和避免凋亡的卓越能力（圖5）。
圖5 通過添加Rnps提高生物墨水的細胞兼容性、打印保真度和抗氧化性
Rnps在復雜結構制造和多材料打印中也展現了良好的性能。作者采用含有Rnps的生物墨水，成功地制作具有TPMS結構的復雜支架，所得結構特征薄壁的厚度在50到150μm之間，在細節上顯示出高分辨率。同時，由于Rnps對于多種生物墨水的良好兼容性，使其能夠在多材料制備中發揮作用，以實現多種材料在空間上的精確分布，比如金字塔模型所示的連續梯度材料的制備，以及如魔方模型所示的多材料一體化打印。EFL研發的多材料DLP生物打印機（EFL-BP8601 Mix）為具有結構復雜性的多材料模型制備提供了平臺。在氣管狀模型、肝小葉、手掌模型等器官結構的仿生構建中，作者利用基于Rnps的多材料打印，模擬了這些器官在結構上的復雜性。為了體現該打印方式在藥物精確負載中的應用，作者設計并構建了具有“NKU”內嵌復雜結構的藥片以及一個多藥物集成負載的藥片模型，以展現其載藥的便利性以及高通量。此外，作者還通過打印不同種類的載細胞空心分叉管結構，展示了基于Rnps的載細胞打印在可灌注血管樣組織制備中的應用。這些結構的成功制備，進一步說明了基于Rnps的打印方法在多種生物醫學場景下的應用潛力（圖6）。
圖6 Rnps在復雜結構制造和多材料打印中的性能
全文總結
本研究中開發了一種簡單而普適的蘆丁基光抑制劑——Rnps，其通過同時進行光吸收過程和自由基反應，能夠有效地減弱DLP 3D打印中光散射的影響，提升打印保真度。與Tar相比，含有Rnps的生物墨水打印速度提升至1.9倍，層間過曝減少58%，分辨率提高38.3%，高精度打印區間擴大至3倍。使用這種光抑制劑制備的支架具有出色的細胞相容性以及出色的抗氧化活性。Rnps能夠適用于各種生物墨水，是創建多材料和多功能生物醫學結構的理想工具。將Rnps集成到其他生物制造平臺中可能會為組織和器官的復雜體外重建提供更多技術支持，從而加速其從理論模型到臨床轉化的發展進程。
南開大學生命科學學院孔德領課題組碩士生李飛逸，本科生李馨月，博士生代殊昕為本文共同第一作者。該研究工作得到國家自然科學基金創新研究群體項目和青年項目，以及博士后基金面上項目與物質綠色創造與制造海河實驗室等項目的支持。在這項研究中，應用了EFL品牌的投影式光固化生物3D打印機（EFL-BP8601 Pro、EFL-BP8601 Mix），和EFL品牌的多種光固化生物材料（EFL-GM、EFL-F127DA、EFL-HAMA等）進行實驗，感謝EFL對研究工作的鼎力支持。
文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05380
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